신장이식 환자에서 mRNA 시퀀싱을 이용한 간질섬유화/세뇨관위축 바이오마커 발굴 = Discovery of Biomarkers Related to Interstitial Fibrosis and Tubular Atrophy after Kidney Transplant by mRNA-Sequencing

국문 초록 (Abstract)

장기부전은 고령사회화에 따르는 문제로, 국내 말기신부전 발병 수는 해마다 증가하고 있다. 신부전의 가장 이상적인 치료법인 신장이식도 그 수가 증가하고 있다. 기술 발전과 면역억제제 사용으로 급성 거부반응의 발생은 감소했으나, 만성적인 이식 병증이 이식 장기 기능 소실의 주요 원인이 되고 있다. 그중 하나가 특정한 원인 없이 나타나는 간질섬유화와 세뇨관위축(interstitial fibrosis and tubular atrophy, IF/TA)이다.
IF/TA는 조직학적 병리 소견 중 하나로, 이식 후 10년이 지나면 거의 모든 환자에서 나타나는 만성적인 신손상을 나타내는 지표이다. 이식 후 1년째 발생한 IF/TA는 즉시 임상적인 변화를 일으키지 않지만, 장기적인 이식신 소실과의 상관성이 있다. 따라서 IF/TA는 프로토콜로 조직검사를 하는 이식신에서 기능 소실을 예측하는 지표 역할을 하여 이식환자에서 특히 중요하다. 그러나, 이식 후 1년째와 신기능 저하가 있을 때 조직검사를 수행하므로 조기 진단이 어려우며 조직검사는 출혈과 같은 합병증의 위험이 있으며 불편을 초래한다. 따라서, 신부전에 이르는 중요한 단계인 IF/TA에 대한 비침습적인 진단법과 치료 전략이 부족하여 전세계에서 주목하고 있다.
이러한 신이식에서의 미충족 수요를 해결하기 위해서 질병 진행에 대한 조기 예측, 개인 맞춤형 치료를 위한 질병의 그룹의 세부적 분류, 질병의 기전에 대한 이해, 진단 및 치료의 타겟이 될 수 있는 바이오마커의 발굴이 필요하다. 이때 활용할 수 있는 방법은 차별발현유전자(differentially expressed gene, DEG) 분석이다. mRNA는 생물학적인 상태를 반영하는 중요한 분자이다. mRNA 발현량은 단백질에 비하여 광범위한 탐색이 용이하며, 질병 진단과 치료 타겟 발굴에 활용성이 높다. DEG를 기반으로 온톨로지 분석, 단백질- 단백질 상호작용(protein-protein interaction, PPI) 네트워크 분석을 수행하여 질병과 관련된 기전을 예측할 수 있다. 신장이식 후 IF/TA 관련 mRNA 발현 분석 선행연구들이 그동안 수행되어왔지만, 대부분 이식신 조직 검체를 이용했다. 임상 활용을 위해서는 보다 덜 침습적인 혈액 검체 바이오마커발굴 연구가 필요하다. 일부 혈액 검체를 사용한 연구들에서도 대상자의 인종과 검체 채혈 시기의 차이로 인해 연구들간의 DEG가 일치하지 않았다. 또한, 모두 microarray 또는 quantitative polymerase chain reaction (qPCR) 연구로 수행되었기 때문에 전체 유전자를 탐색한 연구는 없었다. 따라서, 차세대염기서열분석(next generation sequencing, NGS) 기술을 활용한 DEG 분석을 통해 혈액 검체를 활용하여 IF/TA에 관여하는 전체 mRNA의 탐색이 필요하다. 본 연구에서는 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 사용하여 NGS를 통해 IF/TA 관련하여 mRNA 발현이 차이가 있는 유전자를 발굴하고자 하였다.
본 연구는 환자-대조군 연구로 수행되었다. 조직검사 결과에 따라 환자군을 분류하였으며, 분류기준은 Banff classification 2013년 버전을 따랐다. IF/TA군은 IF/TA 단독, 또는 IF/TA와 borderline change (suspicious acute T cell-mediated rejection)로 진단된 자로 정의하였다. 대조군은 조직검사에서 IF/TA, 원인 질환의 재발, 거부반응을 포함한 어떠한 진단도 받지 않은 자로 정의하였다. 일차 평가변수는 IF/TA 발생군과 비발생 대조군 간의 mRNA 발현량 차이였다. 이차 평가변수는 DEG의 바이오마커로서의 기능, DEG 발현과 유의미하게 연관성이 있는 생물학적 용어, DEG들간의 상호작용 네트워크, IF/TA 진행 정도에 따른 DEG 발현량 차이였다. 포함기준은 2015년에서 2018년 사이에 서울대학교 병원에서 신장이식을 받은 후 1년째 프로토콜 조직검사를 받은 자이다. 모든 연구 대상자들은 이식 시점에 tacrolimus, mycophenolate mofetil 또는 mycophenolate sodium, steroid로 구성된 삼중요법 면역억제제를 사용했다. 다른 임상연구에 등록된 자, 18세 미만 또는 70세 이상인 자, 재이식을 받은 자, 추적 관찰이 불가한 자, 1년째 조직검사 시점에 활동성 감염이 있었던 자, 신장이식 후 악성종양을 진단받은 자, 1년째 조직검사 결과와 이후 추가 조직검사 결과가 일관되지 않은 자는 제외되었다. 포함제외 기준에 부합한 환자들을 대상으로 연구참여 동의를 받았다. 본 연구는 서울대학교병원 연구윤리위원회의 승인을 받았다(IRB No.1904-094-1027).
2020년 1월부터 2020년 8월 사이에 연구대상자 외래 방문 시 말초 혈액 10 mL을 EDTA 튜브(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)에 채취하여 냉장 보관하였다. Lymphocyte-separation medium (3 mL; MP Biomedicals, Solon, OH, USA)을 사용한 PBMC 분리는 채혈 후 3시간 이내에 수행하였다. 분리된 PBMC는 분석 전까지 –70℃에서 보관하였다. RNA 추출은 RiboPure-blood kit (RiboPure RNA Purification Kit, Blood, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였다. RNA 순도는 NanoDrop8000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였다. RNA 무결성은 2100 Bioanalyzer instrument (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 평가하였다. mRNA 시퀀싱 라이브러리 제작에는 Truseq stranded mRNA library prep kit (Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용했다. 시퀀싱은 Novaseq 6000 sequencing system (Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용했다. DEG 분석은 Tuxedo protocol을 사용했다. 참조유전체에 리드 매핑은 Tophat, DEG 분석은 Cuffdiff (Cufflinks)를 사용했다. DEG cut-off값은 |log2(fold change)| ≥ 1, False discovery rate (FDR)-adjusted p-value (q- value) < 0.1로 정의했다. 온톨로지 분석은 Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID)를 사용했다. 일부 DEG들에서 qPCR 분석을 수행하여 mRNA 시퀀싱에서의 유전자 발현량을 검증했다. qPCR은 TaqMan assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용했으며, 유전자 발현량은 delta-delta Ct 방법으로 계산하였다.
인구통계학적 분석은 변수의 특성에 따라서 빈도(%), 평균 ± 표준편차, 중앙값과 범위로 나타내었다. 연속형 변수에 대한 그룹 간 차이 분석은 t-test와 Wilcoxon rank sum test를 수행하였고, 범주형 변수에 대한 그룹 간 차이 분석은 chi-squared test와 Fisher’s exact test를 수행했다. 조직검사와 채혈시점 사이 시간 범위가 넓어서 이 사이에 신장 상태가 유의미하게 변하였을지 간접적으로 평가하기 위하여 조직검사과 채혈 시점 사이의 eGFR의 차이 분석을 paired t-test를 사용하여 수행했다. 도출된 DEG들을 입력값으로 하여 PPI 네트워크 분석을 수행하였다. 분석에는 STRING database를 사용했다. DEG의 바이오마커로서의 기능 평가를 위하여 area under the receiver operating characteristic curve (AUROC)를 계산하였다. IF/TA 진행 정도(Banff classification ci, ct score)에 따른 주요 DEG의 발현량에 대한 다중 비교에는 One-way analysis of variance (ANOVA) 또는 Kruskal–Wallis test with Dunn’s multiple comparisons를 수행하였다. 통계 프로그램으로는 R v4.0.3을 사용하였다.
포함 및 제외 기준에 부합하고 연구에 동의하였으며 RNA의 품질 평가를 통과한 연구 대상자는 IF/TA군 41명, 대조군 41명이었다. BMI, 투석 종류, 기저 질환, 공여자 유형, 공여자 연령 및 수술 후 일수의 분포는 그룹 간에 차이가 없었다.
IF/TA와 관련된 34개의 DEG가 도출됐으며 그 중, ADAMTS2가 AUROC 값 0.765로 가장 컸고, 평균 발현량이 IF/TA군에서 대조군에 비하여 3.5배 높았다. mRNA 시퀀싱 결과는 NCBI’s Gene Expression Omnibus database에 등록하였다(GSE218048). mRNA 시퀀싱 결과 검증을 위하여, 일부 DEG 발현을 qPCR로 분석한 결과 mRNA 시퀀싱 결과와 유사하였다. DEG들과 관련된 상위 10개 온톨로지 용어 중 ADAMTS2와 관련된 용어는 단백질성 세포외기질이었다. PPI 네트워크 분석 결과 52개 노드와 147개의 상호작용이 도출되었으며, PPI enrichment p-value는 2.2 x 10-16로 DEG들간 유의미한 상호작용이 있었다. ADAMTS2는 MMP gene family와 연결되어 있었다. 주요 DEG로 도출된 ADAMTS2에 대한 추가 분석에서는 환자들을 ci, ct 점수, IF/TA 단계에 따라 나눈 결과, 대체로 IF/TA 진행 관련 점수가 증가함에 따라 ADAMTS2 발현량도 증가하였다.
결론적으로, 본 연구를 통해 신이식 환자에서의 PBMC에서 34개의 IF/TA 관련 유전자가 도출되었다. ADAMTS2가 가장 발현량 차이가 컸으며, 비침습적인 IF/TA 진단 바이오마커로의 활용 가능성을 나타내었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Interstitial fibrosis and tubular atrophy (IF/TA) after kidney transplantation causes a chronic deterioration of graft function. IF/TA can be diagnosed by means of a graft biopsy, which is a necessity as noninvasive diagnostic methods are unavailable. In this study, we identified IF/TA-related differentially expressed genes (DEGs) through next-generation sequencing using peripheral blood mononuclear cells. Blood samples from kidney transplant recipients undergoing standard immunosuppressive therapy (tacrolimus/mycophenolate mofetil or mycophenolate sodium/steroid) and diagnosed as IF/TA (n = 41) or normal (controls; n = 41) at their one-year protocol biopsy were recruited between January of 2020 and August of 2020. DEGs were derived through mRNA sequencing and validated by means of a quantitative real-time polymerase chain reaction. We identified 34 DEGs related to IF/TA. ADAMTS2, PLIN5, CLDN9, and KCNJ15 demonstrated a log2(fold change) of > 1.5 and an area under the receiver operating characteristic curve (AUROC) value of > 0.6, with ADAMTS2 showing the largest AUROC value and expression levels, which were 3.5-fold higher in the IF/TA group relative to that observed in the control group. We identified and validated DEGs related to IF/TA progression at one-year post-transplantation. Specifically, we identified ADAMTS2 as a potential IF/TA biomarker.

목차 (Table of Contents)

• 제 1 장 서 론 1
• 제 1 절 연구의 배경 1
• 제 2 절 연구의 목적 12
• 제 2 장 연구 방법 13
• 제 1 절 연구설계 및 평가변수 13
• 제 2 절 연구 집단 14
• 제 3 절 검체 준비 19
• 제 4 절 mRNA 시퀀싱을 통한 차별발현유전자 분석 23
• 제 5 절 통계 분석 방법 28
• 제 3 장 연구 결과 31
• 제 1 절 연구 대상자의 임상적 특징 31
• 제 2 절 IF/TA 관련 차별발현유전자 45
• 제 3 절 온톨로지, PPI 네트워크 분석 결과 55
• 제 4 절 통계 분석 결과 68
• 제 4 장 고 찰 78
• 제 5 장 결 론 90
• 참고문헌 91
• Abstract 105
• Acknowledgement 107