Role of CUG2(cancer-upregulated gene 2) in the subcellular localization of β-TrCP1

국문 초록 (Abstract)

Cancer-upregulated gene 2(CUG2)는 항암제 개발을 위한 표적 유전자로 새롭게 찾아지게 되었다. 여러 암 조직에서 과 발현 되어있는 모습을 보이며 특히, 난소, 간, 폐암 조직에서 높은 발현 양을 나타낸다. 또한, 쥐의 섬유아세포주에 CUG2를 과 발현 시켰을 시 정상 세포가 암 세포화 되는 모습을 통해 CUG2가 암 형성에 크게 기여하는 인자임이 확인 되었다. 세포 내 CUG2의 기능을 규명하기 위하여 CUG2와 결합하는 여러 단백질들이 찾아지게 되었고 그 중에는 mRNA 형성에 관여하는 hnRNP U와 SCF ubiquitin ligase complex의 구성인자 중 하나인 β-TrCP1이 속해있다. 흥미롭게도 hnRNP U는 β-TrCP1의 모조 기질이며 β-TrCP1의 세포 내 위치를 조절하는 단백질이다. β-TrCP1은 여러 종류의 단백질을 기질로 갖는데 이러한 단백질들은 세포의 핵과 세포질에 모두 존재하기 때문에 β-TrCP1의 핵과 세포질 사이의 이동 과정은 매우 중요한 부분이다. 본 연구는 이러한 사실을 기반으로 CUG2가 β-TrCP1의 세포 내 위치에 영향을 줄 수 있는지 알아 보고자 했다. 이를 위해 CUG2의 여러 mutant들을 제작하였고, 이들 mutant가 β-TrCP1의 세포 내 위치에 영향을 끼치는지 알아 보았다. 실험 결과, β-TrCP1은 본래 핵에 주로 위치하지만 CUG2를 인위적으로 세포질에 위치하도록 만든 CUG2 NLS mutant와 CUG2-NES와 함께 발현되었을 시에는 β-TrCP1이 세포질로 이동된 모습을 보였다. 또한, CUG2가 β-TrCP1의 핵 내 위치와 연관되어 있음을 확인할 수 있었다. 더 나아가, H293-Flag-β-TrCP1 stable cell line과 H293-Flag-NES-β-TrCP1 stable cell line을 제작하여 두 세포에서 β-TrCP1의 기질 단백질의 양을 비교해 보았을 때 큰 차이가 나타났고 세포의 이동성에도 서로 다른 모습을 보였다. 이들 결과를 통하여 CUG2가 hnRNP U와 마찬가지로 β-TrCP1의 세포 내 위치에 영향을 주며 β-TrCP1이 핵에 위치할 때 세포의 이동성이 증가하는 모습을 확인할 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cancer-upregulated gene 2(CUG2) is a new gene discovered for using as an anti-cancer drug target. It was identified as a high up-regulated gene in various human cancer tissues, especially in ovary, liver and lung. Also, it showed high proto-oncogenic activities when overexpressed in mouse fibroblast cell line. To analyze the functions of CUG2, various interacting proteins have been found. Among them, hnRNP U is a pre-mRNA processing protein enriched in the nuclear matrix and β-TrCP1 is a F-box protein of SCF ubiquitin ligase complex. Interestingly, hnRNP U is a pseudosubstrate of β-TrCP1 and regulates its subcellular localization. Nuclear-cytoplasmic shuttling of β-TrCP1 is critical because β-TrCP1 should be able to recognize specific substrates in both cytoplasm and nucleus. This research is focused on that point and we constructed several CUG2 mutants and examined their effects on the localization of β-TrCP1. β-TrCP1 dominantly locates in the nucleus, whereas it was translocated to cytoplasm when co-expressed with CUG2 NLS mutant or CUG2-NES which was enforced the cytoplasmic localization. Also, we found that CUG2 relates to nuclear β-TrCP1 localization. Furthermore, H293-Flag-β-TrCP1 stable cells and H293-Flag-NES-β-TrCP1 stable cells showed totally different protein levels of substrates and cell migration. These findings suggest that CUG2 controls the nuclear-cytoplasmic trafficking and activity of β-TrCP1 with hnRNP U and nuclear accumulation of β-TrCP1 promotes cell migration.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction………………………………………………………2
• II. Materials and methods………………………………………4
• 1. Cell culture and transient transfection………………………4
• 2. Plasmidconstruction……………………………………………4
• 3. Antibodies………………………………………………………5
• 4. GST pull down assay…………………………………………6
• 5. Immunoblotting…………………………………………………6
• 6. Immunofluorescence microscopy……………………………7
• 7. Cellular Fractionation…………………………………………7
• 8. Wound healing assay…………………………………………8
• 9. Cell migration assay…………………………………………8
• III. Results…………………………………………………………9
• 1. CUG2 determines the subcellular localization of β-TrCP1 like hnRNP ……………9
• 2. β-TrCP1 has no effect on the subcellular localization of CUG2……………………13
• 3. CUG2 and hnRNP U regulate β-TrCP1 localization via different binding site……15
• 4. The relationship between CUG2 and hnRNP U in binding to β-TrCP1……………17
• 5. The subcellular localization of β-TrCP1 is important to target its substrates……20
• 6. Nuclear localization of β-TrCP1 enhances cell migration..………………………24
• IV. Discussion……………………………………………………28
• V. REFERENCE…………………………………………………30
• 국문초록……………………………………………………………34
• 감사의 글 …………………………………………………………37