High-concentration production of L-theanine using novel gamma- glutamylmethylamide synthetase with ATP regeneration = ATP 재생 시스템과 신규 감마-글루타밀메틸아미드 합성효소를 통한 L-테아닌의 고농도 생산 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

L-theanine, a non-protein amino acid predominantly found in green tea, is renowned for its unique flavor and diverse physiological benefits, including cognitive enhancement and stress reduction. Traditional extraction methods for L-theanine are costly and inefficient, prompting the exploration of enzymatic synthesis as a more viable alternative. This study presents the development of a highly efficient enzymatic production of L-theanine using glutamate derived from fermentation, through a series of systematic approaches. Our work incorporates novel enzyme screening, the use of new metal cofactor, and the enhancement of ATP regeneration efficiency through innovative approaches, along with hybrid nanoflower immobilization, each representing a new perspective in the optimization process. Through a homology-based screening of 1,000 GMAS candidates, M3GMAS from Methylobacillus sp. MM3 was identified as exhibiting the highest L-theanine productivity, significantly surpassing the previously reported MmGMAS (1.78-fold increase). Coupling M3GMAS with the PPK2-III enzyme from Erysipelotrichaceae bacterium significantly improved ATP regeneration, achieving a 70% conversion with 350 mM L-theanine production under optimized conditions. Further enhancements were attained by co-immobilizing these enzymes in inorganic hybrid nanoflowers (CoHNF), which mitigated substrate and product inhibition, leading to an impressive yield of 630 mM L-theanine at high substrate concentrations. This work demonstrates a highly efficient and scalable method for L-theanine production, integrating advanced biotechnological processes with traditional biomass-derived substrates.

국문 초록 (Abstract)

L-테아닌은 녹차에서 과량으로 발견되는 비단백질성 아미노산으로, 독특한 풍미와 인지 기능 향상, 스트레스 감소 등 다양한 생리학적 이점으로 잘 알려져 있습니다. 전통적인 L-테아닌 합성 방법은 비용이 많이 들고 비효율적이기에, 보다 실용적인 대안으로 효소적 생합성 방법이 주목받고 있습니다. 본 연구는 체계적인 접근을 통해 고효율 L-테아닌 효소 생합성 시스템을 구축하였습니다. 본 연구에선 새로운 효소 스크리닝 및 고효율 효소 발굴, 금속 보조인자 교체를 통한 반응성 개선, 혁신적인 고효율 ATP 재생산 시스템 구축, 그리고 하이브리드 나노플라워 고정화 등을 포함하며, 각각은 최적화 과정에서의 새로운 관점과 접근법을 제시합니다. 1,000개의 GMAS 후보군에 대한 상동성 기반 스크리닝을 통해, Methylobacillus sp. MM3에서 유래한 M3GMAS가 가장 높은 L-테아닌 생산성을 보임을 확인하였고, 이는 기존에 보고된 MmGMAS보다 1.78배 높은 수준입니다. M3GMAS와 Erysipelotrichaceae bacterium 유래의 PPK2-III 효소를 결합한 ATP 재생산 시스템을 구축, ATP 재생 효율이 크게 향상된 커플링 반응을 통해 최적화된 조건에서 70%의 전환율과 350 mM의 L-테아닌 생산을 달성했습니다. 이후 두 효소를 무기 하이브리드 나노플라워(CoHNF)에 공동 고정화함으로써 기질과 생성물 저해를 완화하고, 커플링 반응의 효율을 극대화함으로써 고농도 기질 조건에서 630 mM의 L-테아닌 생합성에 성공하였습니다. 본 연구는 첨단 생명공학 공정을 통해 전통적인 바이오매스 유래 기질인 글루타메이트로 부터의 고효율적이고 확장 가능한 L-테아닌 생산 방법을 제시합니다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Materials and methods 4
• 2.1. Chemicals, strains and cultivation 4
• 2.2. The expression and purification of enzymes 4
• 2.3. Co-immobilization of M3GMAS and EbPPK on HNF 5
• 2.4. Quantification of glutamate, ethylamine and L-theanine 5
• 2.5. Enzymatic reaction 6
• 2.6. Surface morphology analysis of HNF by scanning electron microscopy (SEM) 7
• Ⅲ. Results 8
• 3.1. Screening of novel GMAS for theanine synthesis 8
• 3.2. Construction of ATP regeneration system 11
• 3.3. The optimization of reaction condition 14
• 3.4. Replacement of Mg2+ cofactor with Mn2+ to enhance theanine productivity 19
• 3.5. Investigation on the yield of ATP from polyP₆ by EbPPK 26
• 3.6. Investigation of enzyme activity constraints in high-concentration theanine production 31
• 3.7. Mitigating substrate and product inhibition in high-concentration reactions using co-immobilized inorganic hybrid nanoflowers 36
• Ⅳ. Conclusion 40
• References 42
• Abstract (in Korean) 47