Apoptogenic activity of apigeninidin toward human leukemia cells : 인체혈액암세포에 있어서 아피제니니딘의 세포자살유도효과

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

We could observe apigeninidin dose-dependent cell death by MTT assay. At the concentration of 100 μM of apigeninidin, HL-60 cells were eliminated about 60.6%. To elucidate apigeninidin affects cell cycle, 100 μM of apigeninidin treated HL-60 cells were stained by propidium iodide and performed Flow cytometry analysis, apoptosis associated sub G1 peak was increased as 58.3%. To understand apigeninidin induced cell death whether caused by apoptosis or necrosis, Annexin V-FITC staining was carried out. Ultimately, in case of apigeninidin treated HL-60 cell, apoptotic cells were more observed than control.
In order to inspect the apigeninidin induced apoptotic pathway, we have executed Western blot analysis. As consequence, we confirmed the activation of caspase-8, caspase-9 and caspase-3 with degradation of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). It demonstrate that apoptogenic activity on HL-60 cells due to apigeninidin might caused by activation of mitochondria-dependent caspase cascade. We have observed apigeninidin possess more cytotoxic on HL-60 cells than on normal peripheral T cells.
As results of analysis of 80% ethanol extracts and organic solvent fractions of 3 sorghum cereals obtained from Rural Development Administration by HPLC, we have confirmed the presence of apigeninidin in 80% ethanol extracts and n-butanol fraction of golden glutinous sorghum.
In spite of insufficient investigation of clinical and side effect about apigeninidin yet, at the point of view about the apigeninidin derived from frequently edible miscellaneous cereal, it has been considered as more attractive anti-tumor agent than another chemical-synthetic materials.

국문 초록 (Abstract)

아피제니니딘이 인체 혈액암 세포주인 HL-60에 미치는 세포독성을 시험한 결과, 농도가 증가함에 따라 세포 사멸이 유도되는 것을 관찰할 수 있었고, 아피제니니딘 100 mM 농도에서 HL-60 세포가 60.6% 가량 사멸하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포주기를 확인하고자 아피제니니딘을 100 mM의 농도로 처리한 HL-60 세포에 PI를 염색하여 Flow cytometry 분석을 한 결과 세포 자살이 유도되는 Sub G1 피크가 58.3% 까지 높아지고, 미토콘트리아 막 전위가 떨어지는 것을 볼 수 있었다. 그리고 아피제니니딘을 100 mM 농도로 처리한 HL-60 세포에 Annexin V-FITC로 염색을 하여 세포괴사로 인한 사멸인지, 세포자살로 인한 사멸인지 여부를 확인한 결과, 세포자살이 유도되는 세포가 아피제니니딘을 처리하지 않은 세포에 비해 많아지는 것을 확인할 수 있었다.
여기서 아피제니니딘으로 인한 HL-60의 세포자살이 유도되는 경로를 살펴보기 위해 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과 caspase-8, caspase-9 와 caspase-3의 활성화와 함께 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)의 분해를 관찰하였다. 이러한 결과로 보아 HL-60 세포에서 아피제니니딘을 통한 세포자살유도효과는 미토콘드리아 의존적 caspase의 활성화로 인한 세포자살 경로를 통해 일어나는 것으로 생각된다. 또한 정상 말초 T세포와 혈액함 HL-60 세포에 미치는 독성을 비교하여, 암세포에 더 민감한 독성을 나타내는 것을 확인하였다.
국립식량과학원 기능성작물부에서 제공받은 3종의 수수 유래의 80% 에탄올 추출물과 유기용매별 분획물을 고성능 액체크로마토그래피로 분석한 결과, 황금찰수수 조곡의 80% 에탄올 추출물 및 n-부탄올 분획에서 암세포 독성을 확인한 아피제니니딘이 존재하였다.
아직 직접적인 임상 실험과 그 효과의 정도나 부작용 등 연구되어야 할 것이 많지만, 매 식사 시 혼식으로 섭취 가능한 잡곡 중 하나인 수수에 존재하는 물질이라는 점에서 다른 화학적 약제들보다 암 예방 및 치료에 있어 매력적인 소재라고 생각된다.

목차 (Table of Contents)

• Introduction 1
• Materials and methods 3
• Reagents, chemicals, antibodies, and cells 3
• Isolation of human peripheral blood mononuclear cells 4
• Cytotoxicity assay 4
• Flow cytometric analysis 4
• Measurement of mitochondrial membrane potential disruption 5
• Annexin V-FITC staining 5
• Preparation of cell lysates and Western blot analysis 6
• Extraction and fractionation 7
• HPLC system and conditions 8
• Results and discussion 10
• Cytotoxicity test of apigeninidin in Human leukemia HL-60 and Jurkat T cells 10
• Flow cytometric analysis of apigeninidin-induced apoptotic cell death 12
• FITC-conjugated Annexin V staining 14
• Activation of caspase cascade in apigeninidin-induced apoptosis 16
• Cytotoxic effect of apigeninidin on human peripheral T cellsctivation of caspase cascade in apigeninidin-induced apoptosis 19
• Extraction and fractionation of miscellaneous cereals 21
• Cytotoxicity test of various sorghum extracts and organic fractions 22
• Identification of apigeninidin as an apoptogenic component in the sorghum seed extracts 25
• Summary 27
• References 29
• Abstract 34