Breast cancer growth inhibition of hwanggeumchal sorghum (Sorghum bicolor Moench) extracts

국문 초록 (Abstract)

본 연구의 목적은 황금찰 수수 추출물 (HSE)이 인간 유방암 세포주 (MDA-MB 231) 및 xenografts 된 마우스 종양에서 유방암 성장을 억제하는지를 조사하는 것이다. Signal transducer and activator of transcription 5 (STAT5b)/insulin-like growth factor-1 (IGF-1R) 및 STAT3/vascular endothelial growth factor (VEGF) pathway는 혈관신생 (angiogenesis)을 통한유방암 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 최근에 보고되었다. STAT5b/IGF-1R pathway는 인간의 유방암 세포의 성장, 분화 및 생존을 조절하고 있다. 그리고 STAT3는 암의 발달과 유방암 등 각종 malignancies의 촉진에 관여하는 종양 전사 인자이다. 종양의 진행에 VEGF가 angiogenesis, 즉 새로운 모세 혈관을 형성하는 과정의 절대 조절자로 작용한다. 또한 최근 항 유방암 효과에 대한 황금찰수수 (HSE)의 연구도 없었다. 이에 우리는 강력한 인간 유방암 세포와 이를 xenografts한 마우스모델의 종양에서 HSE가 STAT5b/IGF-1R pathway와 종양내의 angiogenesis 발현의 억제 여부에 대하여 연구를 수행하였다.
HSE를 처리한 인간 유방암 세포주 (MDA-MB 231)로부터 MTT assay를 통해 HSE 농도에 따른 세포독성을 실험하였으며, STAT5b/IGF-1R pathway와 STAT3/VEGF pathway를 통한 angiogenesis 발현에 대한 실험을 Western blot, RT-PCR, EMSA, Luciferase assay 등으로 수행하였다. 그리고 사람의 유방암세포 (MDA-MB 231)를 이식한 xenograft 마우스 모델을 이용하여 유방종양 성장의 억제를 확인하기 위하여 in vivo 실험으로 종양 size 측정, 조직의 H&E staining, Immunohistochemistry 및 조직 내 protein에 대한 Western blot 등을 수행하였다.
HSE는 실질적으로 MDA-MB 231세포의 생존력을 농도 의존적으로 감소시켰고 이를 통하여 우리는 IC50값을 확인하였다. 세포와 이종이식 마우스 모델의 종양에서 STAT5b/IGF-1R와 STAT3/VEGF signal pathway의 관련 단백질 수준을 억제/감소시켰으며 농도, 시간에 의존적으로 signal pathway의 발현이 억제됨을 확인하였다. 또한 VEGF-R2, Cyclin D1, janus-activated kinase 2 (JAK2), estrogen receptor α (ERα) 및 Breast tumor kinase (Brk)가 HSE에 의해 감소되었다. 하지만 종양 억제유전자들(tumour suppress genes)인 p53 단백질 수준은 변함이 없었고 BRCA1의 발현은 오히려 증가하였다. VEGF와 IGF-1R의 mRNA 발현 또한 HSE에 의해 억제되었으며, 이는 STAT5b와 IGF-1R promoter의 DNA-binding 활성도에서도 같은 결과를 보였다. HSE가 처리된 세포 안에서의 STAT5b/IGF-1R 유전자 간 그리고 STAT3/VEGF 유전자 간의 상호작용 (interaction) 역시 현저하게 억제되었다. 궁극적으로, xenograft 마우스 모델의 종양의 성장이 HSE에 의해 효과적으로 상당히 억제됨을 확인하였고 HSE가 처리된 마우스의 종양은 처리하지 않은 대조군의 마우스와 대조적으로 종양의 necrosis가 활발히 이루어졌다. 면역 형광염색을 통해 종양의 조직에서도 인산화 된 STAT5, IGF-1R 및 STAT3 단백질 그리고 VEGF, VEGF-R2 및 hypoxia inducible factors (HIF-1α) 단백질의 발현량이 감소함을 확인하였다.
STAT5b, IGF-1R, STAT3, VEGF, VEGF-R2, Cyclin D1, JAK2, ERα, Brk 및 HIF-1α 등과 같이 유방암 생성 및 증식에 기여하는 인자들은 HSE에 의해 모두 억제 되었고, 암 억제 단백질인 p53과 BRCA1 등에는 영향을 받지 않거나 오히려 발현량이 증가하였다. 따라서 황금찰 수수는 잠재적으로 항 유방암에 대한 효과적인 후보 chemopreventive 또는 치료 물질로써의 가능성과 방향을 제시할 수 있을 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The objective of this study was to investigate antiproliferative activity and cytotoxicity potential of Hwanggeumchal sorghum extracts (Sorghum bicolor Moench, HSE) on human breast cancer cell line (MDA-MB 231) in vitro and Human Breast Cancer Xenografts in vivo. Recently these are reports that signal transducer and activator of transcription 5b (STAT5b)/insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R) pathway and angiogenesis are to play an important role in breast cancer. Human breast cancer cells are regulated proliferation, differentiation, and survival by STAT5b/IGF-1R. In addition, STAT3 is an oncogenic transcription factor involved in development and furtherance of various malignancies including breast cancer. Furthermore, the vascular endothelial growth factor (VEGF) in tumour progression acts as a absolute regulator of angiogenesis in the process of forming new capillaries. Recently, There are no reports on the effect of HSE for anti-breast cancer. Hereupon, we have studied whether HSE suppresses tumour with regard to the expression of STAT5b/IGF-1R pathway and angiogenesis.
We have studied cytotoxicity of HSE concentration test according to the MTT assay from MDA-MB 231 cells, and tested on the expression of STAT5b/IGF-1R pathway and angiogenesis by Western blot, RT-PCR, EMSA and Luciferase assay. In addition, we have studied suppression of tumour growth according to the measurement of tumour size, histomorphological assessment staining and Immunohistochemistry of the xenograft model tissues, Western blot for the tissue protein.
HSE substantially decreased the viability of MDA-MB 231 cells in a dose-dependent manner and we confirmed the IC50. HSE inhibited/decreased STAT5b, IGF-1R, STAT3 and VEGF signal pathway in protein levels. HSE suppressed STAT5b/IGF-1R and STAT3/VEGF signal pathway in concentration/time dependent manners in MDA-MB 231 cells and Xenograft tumours in nude mice. In addition, STAT3, VEGF, VEGF-R2, Cyclin D1, janus-activated kinase 2 (JAK2), estrogen receptor α (ERα) and Breast tumor kinase (Brk) were suppressed by HSE. However, helpful signal pathway for anti-cancer that the p53, BRCA1 (tumour suppress gene) protein levels did not change or overexpress. Expression of VEGF and IGF-1R mRNA levels were suppressed by HSE. The STAT5b DNA-binding activities to IGF-1R promoter (STAT5 to the IGF-1R site) and activation of STAT5b/IGF-1R and STAT3/VEGF promoter were markedly suppressed in HSE-treated cells. Ultimately, we confirmed that HSE effectively suppressed the growth of xenograft tumour volume in the xenograft models and the tumour tissues of the xenograft models treated by HSE markedly increased tumour necrosis compared to untreated in tissue levels. By immunofluorescence, we were able to confirm that STAT5b, IGF-1R, STAT3 and VEGF reduced in tumours in mice treated with HSE in a dose dependent manner. And the expression of p-STAT5b, p-IGF-1Rβ and p-STAT3 were suppressed in the tumour tissues.
The critical factors such as STAT5b and IGF-1R, STAT3, VEGF, VEGF-R2, Cyclin D1, JAK2, ERα, Brk and hypoxia inducible factors 1α (HIF-1α) causing breast cancer were suppressed by HSE. Thus, our results indicate that HSE may be potentially effective chemopreventive or therapeutic agent for breast cancer.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction = 1
• Ⅱ. Materials and Methods = 4
• 1. Reagents = 4
• 2. Sorghum extracts = 5
• 3. Human breast cancer cell culture = 5
• 4. Total cell lysis and western blot = 5
• 5. Cell proliferation study by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H- tetrazolium bromide (MTT) assay = 6
• 6. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) = 7
• 7. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) = 7
• 8. Cotransfection and luciferase reporter assay = 8
• 9. Tumourigenicity = 9
• 10. Immunohistochemistry = 10
• 11. Statistics analysis = 10
• Ⅲ. Results = 11
• 1. STAT5b/IGF-1R and STAT3/VEGF signal pathway related-protein expression inhibition of HSE in an aggressive human MDA-MB 231 breast cancer cells = 11
• 2. Cytotoxicity of HSE in human MDA-MB 231 breast cancer cells = 16
• 3. IGF-1R and VEGF mRNA expression inhibition of HSE = 18
• 4. STAT5b/IGF-1R and STAT3/VEGF signal pathway related-protein expression inhibition of HSE in dose and time dependent manners = 21
• 5. STAT5 to the IGF-1R and STAT3 to the VEGF promoter sites binding inhibition of HSE = 25
• 6. STAT5b/IGF-1R and STAT3/VEGF promoter activities by HSE = 27
• 7. Suppression of breast tumour growth in human breast cancer xenograft models = 29
• 8. Histophathological changes of HSE in xenograft mice = 32
• 9. Morphological changes: STAT5b/IGF-1R and STAT3/VEGF signal pathway protein expression inhibition in tissue levels of xenograft mice = 34
• 10. STAT5b/IGF-1R and STAT3/VEGF signal pathway, and HIF-1α related-protein expression inhibition of HSE in xenograft mice = 38
• Ⅳ. Discussion = 41
• Ⅴ. Conclusion = 46
• Ⅵ. References = 47
• Abstract in Korean = 56