Melatonin synergistically increases resveratrol-induced heme oxygenase-1 expression through the inhibition of ubiquitin-dependent proteasome pathway : A possible role in neuroprotection

국문 초록 (Abstract)

Melatonin (MEL)은 송과선에서 분비되는 indoleamine 계열의 물질이다. 뿐만 아니라 식물에서도 자연적으로 합성되는데, 이중 하나인 resveratrol (RSV)은 많은 종류의 식물류에서 자연적으로 합성이 되며, 특히 적포도주의 주 성분으로서 신경보호작용과 항산화의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근 연구된 바에 의하면, RSV은 알츠하이머 치매나 뇌졸중에서 신경세포의 사멸을 억제하는 것으로 알려져 있고, MEL이 첨가되면 알츠하이머 치매로 인한 인지 능력 손상이 회복이 되는 것으로 나타났다. HO-1(heme oxigenase-1)은 특정 조직에 항산화 효과를 줄 수 있는 산화 환원반응 조절 효소이다. 본 실험에서는 MEL과 RSV을 함께 처리했을 때, HO-1을 통한 신경 보호의 역할이 나타나는지를 in vitro상에서 관찰 하였다. RSV을 첨가한 군에서는 태아의 대뇌피질의 뇌세포와 별아교세포에서 첨가한 RSV의 농도에 따라 HO-1단백질의 발현량이 증가하는 것을 관찰 하였다. 반면에 MEL을 첨가한 군에서는 MEL의 농도에 따라 HO-1 단백질의 발현량에 큰 차이를 보이지 않았다. RSV과 MEL을 함께 첨가한 군에서는 HO-1 단백질의 발현이 RSV만 처리한 군에 비해 더욱 증가하였다. 그러나 HO-1 mRNA의 발현량은 RSV 처리에 의해서만 증가했을 뿐, MEL과 RSV+MEL 처리한 군에서는 모든 농도에서 비슷하게 나타나는 것을 확인 하였다. 태아의 대뇌피질의 뇌세포와 해마의 절편 배양에서 과산화수소로 인한 산화적 신경 독성에 대해서 MEL이나 RSV 하나만 처리 한 군에 비해 MEL과 RSV을 함께 처리한 군에서 현저히 감소한 것이 나타났다. HO-1 단백질의 발현을 HO-1 mRNA에 특이적인 shRNA를 이용하여 억제시켰을 때, MEL과 RSV의 처리에 의한 HO-1 단백질의 발현에 대한 증가 효과는 나타나지 않았고, 과산화수소에 의한 산화적 손상에 대한 신경 보호 효과를 억제하는 것으로 나타났다. proteosome의 억제제로 알려져 있는 MG132와 RSV을 함께 처리함으로써, MEL+RSV을 처리한 효과와 비슷하게 만들어 실험한 결과, MEL과 RSV을 함께 처리한 것과 같은 결과를 얻음으로서 MEL과 RSV에 의한 HO-1 단백질 발현의 증가는 HO-1의 ubiquitination을 억제함으로서 나타남을 확인하게 되었다. 이러한 결과는 MEL이 ubiquitin 의존적인 proteosome pathway를 억제함으로써 HO-1의 발현을 더욱 증가시킴으로 인해, 산화적 손상으로부터의 신경 보호 역할을 하는 RSV의 기능을 더욱 좋게 함을 알게 되었다. 본 실험에서 밝혀진 MEL과 RSV의 혼합처리에 의한 신경 보호 기능은 신경손상으로 인한 장애를 치료하는데 보다 효과적인 방법을 제시한 것이라 볼 수 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Melatonin is an indoleamine secreted by the pineal gland as well as a plant-derived product and resveratrol (RSV) is a naturally occurring polyphenol synthesized by a variety of plant species; both molecules act as a neuroprotector and antioxidant. Recent studies have demonstrated that RSV reduced the incidence of Alzheimer’s disease and stroke, while melatonin supplementation was found to reduce the progression of the cognitive impairment in AD. The HO-1 is an inducible and redox-regulated enzyme that provides tissue-specific antioxidant effects. We assessed whether the co-administration of melatonin and RSV shows synergistic effects in terms of their neuroprotective properties through HO-1. RSV significantly increased the expression levels of HO-1 protein in a concentration-dependent manner both in primary cortical neurons and astrocytes, while melatonin per se did not. Melatonin+RSV showed a synergistic increase in the expression levels of HO-1 protein but not the HO-1 mRNA level compared to either melatonin or RSV alone. Treatment of melatonin+RSV significantly attenuated the neurotoxicity induced by H2O2 in primary cortical neurons, and also in organotypic hippocampal slice culture. The blockade of HO-1 induction by shRNA attenuated HO-1 induction by melatonin+RSV and hindered the neuroprotective effects against oxidative stress induced by H2O2. The treatment of MG132+RSV mimicked the effects of melatonin+RSV, and melatonin+RSV inhibited ubiquitination of HO-1. These data suggest that melatonin potentiates the neuroprotective effect of RSV against oxidative injury, by enhancing HO-1 induction through inhibiting ubiquitination-dependent proteasome pathway, which may provide an effective means to treat neurodegenerative disorders.

목차 (Table of Contents)

• 1. Abstract
• 2. Introduction = 1
• 3. Materials and Methods = 4
• 3.1 Materials = 4
• 3.2 Cell culture = 4
• 3.3 Organotypic hippocampal slice culture = 5
• 3.4 Drug treatment = 6
• 3.5 Reverse Transcriptase-PCR(RT-PCR) = 6
• 3.6 Western Blot analysis = 7
• 3.7 Immunoprecipitation = 7
• 3.8 Measurement of cell viability = 8
• 3.9 Determination of ROS production = 8
• 3.10 Lentiviral infection for HO-1 gene knockdown = 9
• 3.11 Statistical analysis = 9
• 4. Results = 10
• 4.1 HO-1 level increased the melatonin+RSV in rat primary astrocyte and neuron = 10
• 4.2 Combination of melatonin and RSV did not further increase the expression level of HO-1 mRNA in rat primary cortical neurons and astrocytes = 14
• 4.3 Melatonin or RSV alone did not prevent the H2O2-induced cell death of rat primary cortical neurons and astrocytes = 16
• 4.4 Combination of melatonin and RSV blocked H2O2-induced cell death in organotypic hippocampal slice cultures = 18
• 4.5 Synergistic induction of HO-1 expression by melatonin+RSV provide neuroprotective effects against oxidative stress-induced neuronal cell death = 20
• 4.6 PI3K/Akt and GSK3β pathway are involved in the melatonin-mediated synergistic increase in RSV-induced HO-1 protein expression, which might also regulate synergistic neuroprotective effects by melatonin+RSV = 22
• 4.7 Melatonin+RSV inhibited ubiquitination of HO-1 protein and subsequent degradation of HO-1 that led to the synergistic induction of HO-1 protein expression = 25
• 5. Discussion = 28
• 6. References = 32
• 7. Abstract in Korean = 39