과일 유래 세포외소포체의 외인성 피부노화 개선 효과 = Therapeutic and protective effects of extracellular vesicles and their miRNAs derived from fruit for aged skin

국문 초록 (Abstract)

피부는 신체 중에서 가장 많은 비중을 차지하는 인체 기관이며, 자외선, 미
세먼지, 독성물질 등 해로운 외부 스트레스가 체내로 들어오는 것을 막아주
는 역할을 한다. 하지만 이러한 외부 스트레스로부터 우리 몸을 보호하는 과정에서 외인성
노화가 발생하게 되고, 발생한 외인성 노화는 피부의 기능을 약화시킬 뿐만
아니라, 검버섯, 피부암 등의 다양한 피부질환까지 유발하게 된다. 이러한 문
제점을 사전에 막기 위해 피부노화 전 단계에서 피부를 관리하는 것에 대한
중요성이 지속적으로 부각되어 왔고, 외인성 스트레스로 인한 노화를 방지할
수 있는 피부재생 효능을 지닌 다양한 소재들에 대한 많은 연구들이 진행되
고 있다. 그중에는 식물과 같은 천연물 유래 추출물을 이용한 연구 개발도
진행되고 있으나, 천연물 유래 성분이 피부 진피층까지 흡수되지 못하고, 성
분 자체의 불안정성으로 인한 한계점으로 인해 천연물이 지닌 수많은 장점
에도 불구하고 여전히 활용도가 떨어지고 있는 것이 사실이다. 최근 이러한 문제점들을 개선할 수 있는 방안으로 안정성은 물론이고 피부
침투력/흡수력까지 높일 수 있는 세포외 소포체 (Extracellular Vesicles,
EVs)를 전달체로서 활용하는 것이 각광을 받고 있다. 세포외소포체는 세포
간 통신을 위해 세포로부터 방출되는 나노 크기의 소포체로 체내의 다양한
장벽을 원활하게 통과할 수 있는 장점이 있으며, 이중 지질 막 구조를 통해
내부의 RNA, 단백질을 포함한 다양한 유효 물질을 안정적으로 보관/보호할 - viii -
수 있다는 장점을 지닌다. 이러한 장점을 지닌 세포외 소포체를 대량 생산하여 활용하기 위한 노력들
이 계속되고 있고, 대량의 생산력을 위해 다양한 인간 세포 및 조직으로부터
세포외 소포체를 얻고자 하는 시도가 이루어지고 있으나, 세포가 분비하는
세포외 소포체의 생산률은 여전히 매우 낮은 편 (고효율의 생산 프로토콜을
확립하더라도 세포외 소포체를 생산할 수 있는 모세포/모조직의 수요가 불
충분함)이며 생산한 세포외 소포체의 활용에 있어서도 안전성/안정성에 대
한 우려가 여전히 존재하고 있다. 이를 개선하기 위해 최근에는 새로운 방법
으로서 식물/과일 유래 세포외 소포체를 활용하는 연구가 활발히 진행 중인
데, 과일유래 세포외 소포체는 배양과정 없이 대량 생산이 가능하며 활용도
에 있어서도 과일/식물로부터 추출하였기에 보다 안전하다는 장점을 지닌다. 이에 우리는 실제로 과일 유래 세포외 소포체가 동물 유래 세포외 소포체를
대체하여 피부 노화 치료제/예방제로 사용할 수 있는지 확인하기 위하여 피
부재생 및 항노화 효능을 검증하였다. 과일 유래 세포외 소포체의 효능 검증을 위해 과일 유래 세포외 소포체를 분
리하고, 그 특성을 분석하였으며, 과일 유래 세포외 소포체 내에 존재하는
miRNA를 분석하여 피부 재생 효능을 나타낼 수 있을지 분석하였다. 또한
과일 유래 세포외 소포체가 실제로 세포 내부로 흡수되어 유효 인자들을 전
달할 수 있는지 검증하고, 마지막으로 miRNA 분석 결과를 실험적 방법을
통해 검증하였다. 연구 결과들을 토대로, 과일 유래 세포외 소포체의 피부 재생 치료제로서의
가능성을 확인할 수 있었고, 과일 유래 세포외 소포체 분리 방법 확립부터
효능 평가 시스템 구축 및 효능 검증 결과 확인을 통해 우리가 개발한 과일
유래 세포외 소포체가 추후 동물 유래 세포외 소포체 기반 치료제 시장을 대- ix -
신할 수 있는 새로운 세포외 소포체 대체체로서의 마중물이 될 수 있을 것으
로 기대한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The skin is the largest organ of the body and has three layers, the epidermis, the
dermis and the subcutaneous layer.
The skin is exposed daily to internal and external stressors including
micro-organisms, radiation and chemicals. External stressors lead to aged phenotype
with wrinkling, sagging, thinning of the epidermis, dry skin, and reduced barrier
integrity as well as cause skin diseases such as skin cancer. Therefore, it is
important to protect of skin from stressors in the pre-aging stage.
Many studies report that the effect of natural phytochemicals is capable of reducing
skin aging or wrinkling. Plant extracts rich in phytochemicals, such as flavonoids,
phenolic acids, saponins, and alkaloids are being investigated in the development of
anti-skin-aging products due to their potential to promote cell proliferation and - 64 -
collagen synthesis. However, phytochemicals have limitations in that they do not
penetrate into the dermal layer of the skin and are unstable.
Recently, extracellular vesicles (EVs) are considered one of the most attractive
approaches for anti-skin-aging. EVs are nano-sized vesicles released from cells
for cell-to-cell communication, and have the advantage of passing through various
barriers in the body. In addition, the extracellular endoplasmic reticulum can stably
protect various effective substances including RNA and protein inside through the
double lipid membrane structure. Despite their promising potential, the application of
EVs for skin-anti-aging is still limited due to insufficient amounts of EV isolation
from mammalian cells or human body fluids. Fruit-derived EVs have the opportunity
of separating from large volumes and, drive cell-cell communication, even between
different organisms and species.
The purpose and hypothesis of this study are to verify whether fruit-derived EVs
replace mammalian cell-derived EVs to have effects on skin regeneration and
anti-aging. To verify the hypothesis, the following procedure was carried out. 1)
Fruit-derived EVs were isolated and their characteristics were analyzed, and 2)
miRNAs present in fruit-derived EVs were identified and examined for the effect of
skin regeneration. 3) In addition, we verified that fruit-derived EVs could actually
deliver their biomolecules into target cells. 4) Finally, based on the miRNA analysis
results, experimental verification for the effect of skin-anti-aging was performed in
in-vitro.
In this study, the possibility of fruit-derived EVs as a therapeutic source of skin
regeneration was evidenced, and fruit-derived EVs are expected that it will become
a new platform to lead the EV-based treatment market in the future

목차 (Table of Contents)

• 감사의 글 ⅰ
• 차 례 ⅱ
• 그 림 차 례 ⅴ
• 표 차 례 ⅵ
• 국 문 요 약 ⅶ
• Ⅰ. 서 론 1
• 1. 피부노화의 원인 1
• 가. 피부노화의 다양한 요인 1
• 나. 피부노화의 발생 기작 1
• 다. 피부노화개선의 중요성 2
• 2. 피부노화 개선 기술들의 문제점 2
• 가. 피부노화 개선을 위한 기술 2
• 나. 피부노화 기술들의 다양한 문제점 3
• 다. 피부노화 기술로써의 세포외 소포체의 활용 3
• 3. 문제점 해결을 위한 식물유래 세포외 소포체 활용 4
• 가. 기존 동물유래 세포외 소포체의 단점 4
• 나. 동물 EV 대체제로써 식물 EV의 장점 5
• 4. 연구목적 5
• Ⅱ. 재료 및 실험 방법 6
• 1. isolation of fruit EVs 6
• 2. Nanoparticle tracking analysis 6
• 3. Transmission Electron Microscopy imaging 7
• 4. Cell culture 7
• 5. fruit EVs safety test 7
• 6. H2O2 cytotoxicity test 8
• 7. RNA isolation 8
• 8. Reverse transcription PCR 9
• 9. Quantitative real-time PCR 9
• 10. Western blot 9
• 11. Fruit EV small RNA sequencing 10
• 12. miRNA putative target analysis 10
• 13. EVs containing GFP plasmid transfection 11
• 14. Statistics 11
• Ⅲ. 실험 결과 13
• 1. Characteristics of EVs derived from fruit 13
• 1-1 TEM 및 NTA 이미징을 통한 EV의 특성 분석 13
• 1-2 NTA를 통한 EV 수득률 및 크기 비교분석 15
• 2. Fruit EVs-miRNA putative target analysis 17
• 2-1 EV 내 존재하는 miRNA 분포도 분석 17
• 2-2 miRNA가 target 하는 cytokine 및 산화스트레스 마커 분석 19
• 2-3 miRNA가 조절할 것으로 예상하는 pathway 분석 40
• 3. Function of Fruit EVs on Skin Aging 42
• 3-1 과일 EV 산화스트레스 보호효과 42
• 3-2 과일 EV의 항산화 효능 검증 44
• 3-3 과일 EV의 항염증 효능 검증 46
• 3-4 세포 노화에 따른 노화 마커 발현량 확인 48
• 3-5 과일 EV의 항노화 효능 검증 50
• 4. Fruit EVs-Host Cell Interaction 52
• Ⅳ. 고찰 55
• Ⅴ. 결론 57
• 참고문헌 58
• 영문요약 63