TUNEL法과 DNA fragmentation法에 의한 흰쥐 腎臟細胞에서 아포토시스의 檢索 比較 = Comparison of TUNEL and DNA Fragmentation methods for Detection of Apoptosis in Rat Kidney

국문 초록 (Abstract)

아포토시스는 염증반응의 동반없이 핵염색질의 분절로 나타나는 생리적인 세포사멸로 기존의 단순염색의 광학현미경적 관찰이나 TUNEL기법을 이용한 면역화학적 방법, 전기영동을 이용한 DNA fragmentation 관찰 등의 다양한 방법으로 확인할 수 있다. 본 연구에서는 아포토시스 관찰을 위한 방법들의 장단점을 비교하기 위하여 cyclosporine A를 처리한 흰쥐의 신장을 시간별로 적출하여 아포토시스의 형태 및 정도를 기존의 단순염색의 광학현미경적 관찰과 TUNEL기법을 이용한 면역화학적 방법, 전기영동을 이용한 DNA fragmentation 관찰을 시행하여 비교하였다. 이들의 결과는 다음과 같다.
1. 아포토시스체는 기존의 H-E 및 PAS 염색에 의한 광학현미경적 방법으로 관찰할 수 있었다. 그러나 쥐의 세뇨관 상피세포에서의 아포토시스체 정량분석을 시행한 결과 cyclosporine A를 투여한 경우와 정상 대조군에서 의의있는 차이를 나타내지 못하였다.
2. Cyclosporine A를 투여한 쥐의 신선한 신장조직에서 아포토시스는 전기영동을 이용한 DNA fragmentation 관찰법에 의해 관찰이 용이하였으나 정량분석에 어려움이 있었고 아포토시스 세포의 조직내 위치확인이 불가능하였다.
3. TUNEL기법을 이용한 면역화학적 방법으로 아포토시스를 관찰한 결과 아포토시스 세포는 TUNEL기법을 이용한 면역화학적 반응에 강하게 반응하였다. 이러한 TUNEL기법을 이용한 면역화학적 방법은 아포토시스를 일으킨 세포뿐만 아니라 아포토시스 과정에 있는 세포의 형태학적 관찰 및 정량분석이 용이하였으며, 조직내에서의 아포토시스 세포의 위치 확인이 가능하였다.
4. Cyclosporine A를 투여한 쥐의 신장조직에서 PCNA염색으로 확인한 세포증식능은 아포토시스와 유의한 연관성을 보였으며, 이는 아포토시스 유발 초기에는 증가되고, 시간이 경과함에 따라 감소되었다.
이상의 결과에서 아포토시스를 관찰하기 위한 방법에서 TUNEL기법을 이용한 면역화학적 방법은 아포토시스의 형태학적 관찰이나 정량분석 및 위치확인에 있어 기존의 H-E 및 PAS 염색에 의한 광학현미경적 방법이나, DNA fragmentation법 보다 우수함을 알 수 있다. 더불어 cyclosporine A를 투여한 쥐의 신장조직에서 PCNA염색으로 확인한 세포증식능은 아포토시스와 유의한 연관성이 있음을 알 수 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Apoptosis is a highly regulated process of cell death characterized by nuclear fragmentation without accompanying inflammatory reaction. It can be detected by specific and selective techniques, such as conventional light microscopy, DNA fragmentation analysis by gel electrophoresis (DNA laddering), and histochemical in situ nick-end labeling (TUNEL) method. To compare each technique for the detection of apoptosis with respect to the qualitative and quantitative analysis, the kidneys of the Sprague Dawley rat treated with cyclosporine A (n=30) were sacrificed according to time and were examined by light microscopy, TUNEL method and DNA laddering. The results were as follows.
1 . Apoptotic bodies of the rat kidney treated with cyclosporine A were occasionally demonstrated by conventional hematoxylin-eosin (H-E) and periodic acid schiff (PAS) stains, however these methods could not discriminate the significant difference in the detection of apoptosis of the renal tubular epithelial cells between the cyclosporine A treated rats and the control rats.
2. Apoptosis could be recognized as the characteristic DNA ladder pattern on agarose gel electrophoresis in the fresh tissues of the rat kidney after the treatment of cyclosporine A, but DNA laddering has limited value in the quantitative analysis and the verification of the site of apoptosis and needed the fresh tissues.
3. Labeling was most intense in apoptotic nuclei on TUNEL method. This method can be adapted for paraffin tissue section. Moreover one can simultaneously assess the quantitative and qualitative analysis of apoptotic cells and cells committed to apoptosis and the localization of staining, making this an incredibly powerful tool for apoptosis detection.
4. Cellular proliferation index demonstrated by PCNA staining correlated with apoptosis in the rat kidney after the treatment of cyclosporine A, which increased in early period and decreased later.
With these results, TUNEL method is superior to conventional light microscopic method such as H-E and PAS staining or DNA fragmentation method for the detection of apoptosis. In addition, these findings suggest that the frequency of apoptosis is significantly correlated with cellular proliferation.

목차 (Table of Contents)

• 목차 = ⅰ
• Abstract = 2
• Ⅰ. 서론 = 4
• Ⅱ. 재료 및 방법 = 8
• 1. 실험 동물 및 약물처리 = 8
• 2. 조직의 처리 = 8
• 3. 일반 조직화학적 염색 = 8
• 4. 효소 면역조직화학적 염색법 = 9
• 5. TUNEL (In situ nick end labeling) 방법 = 10
• 6. DNA fragmentation 방법 = 10
• Ⅲ. 결과 = 12
• 1. 신장의 조직학적 변화 = 12
• 2. TUNEL기에 의한 아포토시스의 검출 = 13
• 3. DNA fragmentation 방법 = 16
• 4. 효소 면역 조직화학적 염색 = 17
• Ⅳ. 고찰 = 20
• Ⅴ. 적요 = 25
• 참고문헌 = 27