Generation of RANKL-derived small fragment proteins for osteoclast inhibition = 파골세포 억제를 위한 RANKL 유래 소형 단백질의 제작

국문 초록 (Abstract)

배경: 골조직은 파골세포와 조골세포의 상호작용을 통해 항상성을 유지합니다. 그러나 과도한 RANK-RANKL 신호에 의해 파골세포가 과도하게 활성화되면 뼈의 손실을 초래하는 골다공증과 같은 질환이 발생합니다. 그런데 최근 LGR4 (leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 4, GPR48이라고도 함)가 RANKL의 또 다른 수용체로 소개되었습니다. LGR4는 RANK와 경쟁하여 RANKL에 결합하며, 파골세포 분화 동안 표준 RANK 신호 전달을 억제합니다. 이를 기반으로 이전 연구에서 RANK 결합 부위를 제거한 RANKL 유래 소형 단백질을 제작하고자 하였고, 225RANKL294-GST 이전 단백질은 파골세포 분화 억제 활성이 없으나 225RANKL295-GST 이후 단백질은 파골세포 분화 억제 활성이 확인되어 225RANKL295-GST가 LGR4의 Ligand로써 선택되었습니다. 하지만 GST-tag는 26 kDa의 비교적 큰 사이즈를 가지며, 자체적으로 Dimer를 형성하는 한계점을 가지고 있습니다. 그래서 이번 연구에서는 225RANKL295를 tag 단백질 없이 intact form으로 제작하고자 하였고, 추가로 295번 아미노산을 점 돌연변이화하여 단백질을 개선하고자 하였습니다.

방법: 이전 연구에서 선택된 225RANKL295-GST 단백질의 GST-tag를 His-tag로 변형하고 TEV cleavage를 통해 Intact form으로 정제하였습니다. 그리고 295번 아미노산을 점 돌연변이를 통해 Proline에서 각각 Glycine, Alanine, Valine, Leucine으로 변형하였습니다. TRAP 검정은 파골세포 분화 억제 효과를 밝히기 위해 157RANKL316으로 유도된 골수 대식세포에서 수행되었습니다.

결과: Intact form의 225RANKL295P가 성공적으로 정제되었고, 파골세포 분화에 대한 억제 효과가 확인되었습니다. 또한 모든 변형된 단백질 후보는 TRAP 활성에 대한 억제 효과를 나타냈습니다. 특히 TRAP 활성에 대해 225RANKL295A가 225RANKL295P보다 높거나 같은 억제 효과를 나타냈습니다.

결론: Intact form의 225RANKL295P의 정제 과정을 확립할 수 있었고, 225RANKL295A라는 개선된 단백질을 제작할 수 있었습니다. 이는 골다공증 치료를 위한 새로운 치료제로서 225RANKL295A의 가능성을 시사하며, 추가 연구를 통해 최적화된 단백질 설계가 가능할 것으로 기대됩니다.

목차 (Table of Contents)

• 1. BACKGROUND 1
• 2. MATERIALS AND METHODS 4
• 3. RESULTS 11
• 4. DISCUSSION 15
• 5. CONCLUSION 17
• 6. REFERENCES 18