肺結核診斷에서 遺傳子再組合 抗原 및 分子 生物學的診斷의 有用性에 관한 硏究 = Evaluation of recombinant antigens and molecular biological laboratory diagnosis for pulmonary tuberculosis

국문 초록 (Abstract)

현재의 결핵을 진단하는데 도말 및 배양검사등을 통한 미생물학적 검사법의 제한점을 보완 할 수 있는 신속하고 간편한 결핵진단방법으로 분자생물학적 방법 및 혈청학적인 방법이 연구되어 왔는데, 결핵의 효과적인 퇴치를 위해 결핵환자를 조기에 발견하기 위한 결핵진단 기술의 개발을 목적으로 하였으며, 그 일환으로 결핵균의 항원을 다양한 방법으로 준비하여그 특성을 조사하는 한편, 이들 항원을 이용하여 결핵진단의 가능성을 조사하고자 하였다.
Purified protein derivative (PPD), lipoarabinomannan (LAM) 및 diacyltrehalose (DAT) 항원을 준비하여 결핵균 항체 검출 진단 실험으로 세브란스 병원 호흡기 내과에 내원한 환자등을 상대로 enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA)를 실시하였다. 결핵환자 124명에 대한 결과는 치료중인 결핵 환자를 포함한 활동성 결핵환자의 70% 정도가 PPD 항원에 대한 항체반응을 보였다. 비활동성 결핵환자의 경우 PPD에 대한 항체양성율이 낮아짐을 보아 치료후에는 항체가가 낮아짐을 알수 있었다. LAM에 대한 항체양성율도 PPD에 대한 항체검사 결과와 크게 다르지 않았다. 도말검사 결과는 15%에서만 양성을 보여 매우 낮은 양성율을 보였으나 반면에 배양검사 결과는 60%가 양성이었다. PPD와 LAM에 대한 항체 검사 양성율은 65%로 배양검사의 민감도와 거의 대등하였다. 배양검사 양성인 객담 24개중 도말검사에서 양성인 경우는 4예 (16.7%)였다. 결핵균 culture filtrate protein (CFP) 항원의 혈청진단 결과에서 활동성 결핵환자 76명 가운데 57명에서 양성 반응을 보여 비교적 높은 민감도를 보였으나 건강대조군 30명중 8명에서 양성기준 흡광도를 초과하여 특이도는 73.3%이었다. 이렇게 특이도가 낮은 이유는 CFP 항원이 정제되지 않아 LAM 항원이나 arabinogalactan등 mycobacteria에 공통항원인 다당류가 일부 포함되어 있기 때문일 것으로 사료되었다.
Diacyltrehalose (DAT) 항원의 혈청진단 효과를 알아보기 위하여 159명의 결핵환자를 대상으로 DAT 항원에 대한 항체를 ELISA로 검사하였다. 검사를 마친 159명의 결핵환자중 110명이 IgG 항체 양성에서 69.2 %의 민감도를 나타냈다. DAT 항원에 대한 주요 항체가는 주로 IgG 항체임을 확인하였다.
유전자재조합 단백질 16 kDa, 19 kDa, 32 kDa, 38 kDa 항원을 준비하여 그 중 r38 kDa 항원의 혈청진단 결과에서는 경증결핵환자 25명, 중등증 결핵 환자 36명, 중증결핵환자 14명의 환자군과 tuberculin음성인 건강대조군 90명을 대상으로 했을 때 경증인 경우의 민감도는 69.2%, 중등증은 88.9%, 그리고 중증은 100%였으며, 건강대조군의 r38 kDa 항원에 특이도는 97%를 보였다. 이는 결핵균 항원에 대한 항체가가 질병의 진행과 밀접한 관련이 있음을 보여주는 결과였다. 또한 r38 kDa 항원을 활동성 결핵환자 76명을 대상으로 배양검사 결과와 비교하기 위해 IgG 항체검사를 실시하였는데, 64명(84.2%)에서 양성 반응을 나타내 비교적 높은 민감도를 나타내었다. Tuberculin음성인 75명으로 BCG 접종후 2주, 2개월, 4개월, 1년후에 혈청을 채취 하여 항체가에 변동 여부를 조사한 결과 일반적으로 평균 흡광도의 변동이 미미함을 보였다. 이 결과로 결핵균의 감염이 어느 정도 진행된 경우에만 항체가 형성됨을 암시하고 있었다. r38 kDa 항원과 CFP 항원과의 항체반응 상관관계를 비교하기위해 76명의 활동성 결핵환자 를 대상으로 항체흡광도를 조사한 결과 상관계수�가 0.69로 통계적으로 유의성은 있었으며, 결핵균 감염시 r38 kDa 항원 이외의 다른 항원에 많은 항체가 형성되는 것으로 보였다. 그리고 r16 kDa 항원과 19 kDa 항원의 혈청진단 실험에서 r16 kDa 항원에 대한 항체가 건강대조군에서는 검출되지 않아 특이도는 매우 높았으나 결핵환자 73명중 31명에서만 항체가 검출되어 민감도는 42.5%로 비교적 낮았다. r19 kDa 항원에 대해서도 환자들의 민감도가 낮았고, 12명(16.4%)정도만 높았는데 그 결핵환자들의 r19 kDa 항원에 대한 항체반응정도가 r16 kDa, r32 kDa, 그리고 r38 kDa 항원에 대한 항체반응 보다 높음을 보여주었다.
선별된 항원을 이용하여 입원 후 치료중인 환자를 대상으로 한 활동성 폐결핵 환자군 400명과 비활동성 폐결핵 환자군 100명과 건강대조군 60명을 대상으로 실험하였다. r38 kDa 항원에 대한 폐결핵 환자군의 민감도는 70%로 약간 낮은 결과를 보이고 있으나 특이도는 93.8%로 높은 결과를 보여 주었다. r14 kDa와 r16 kDa 항원에 대한 폐결핵 환자군의 민감도는 42.1%와 43.9%였으며, 양성예측도는 각각 92.3%와 92.6%로 높았으며, 특이도는 95.8%로 상당히 높았다. r19 kDa와 r23 kDa 항원에 대한 폐결핵 환자군의 민감도는 15.8%와 28.1%로 낮았으나 특이도는 91.7%와 89.6%로 높았다. r14 kDa, r16 kDa, r19 kDa와 r23 kDa 항원의 경우는 단독보다는 r38 kDa 항원등과 적절한 혼합를 통해 사용 된다면, 민감도 및 특이도가 보완된다면 결핵진단에 도움이 된다고 보여주었다.
혼합항원을 이용한 혈청학적 진단과 환자 객담을 이용한 PCR 진단과의 비교 실험으로 결핵 진단에 대한 정확성을 살펴보고자 하였다. 대상별 결핵환자는 활동성 폐결핵환자 114명을 대상으로 하였다. 그 대상 중 A군은 입원환자로 도말검사에서 양성 결과가 나온 환자들로 41명이었고, B군은 입원환자로 도말검사에서 균음전화 직후인 환자들(1개월 이내)로 40명이었으며, C군은 입원환자로 도말검사에서 균음전화가 3회이상 결과가 나온 환자들로 33명이었다. 환자접촉군은 80명이었으며, 건강대조군은 61명을 대상으로 하였다. 혈청학적 진단과 객담을 이용한 polymerase chain reaction (PCR) 진단과의 비교 실험에서 환자 군의 남녀 성별 분포는 대상 환자 114명중 남성은 96명, 여성 환자는 18명으로 남자환자 의 비율이 약 5배 많았다. 결핵환자 접촉군의 평균 나이는 약 37세로 결핵 환자군이 평균 8세 정도 많았다. 결핵환자군의 결핵 이환기간은 평균 약 6년(71.8개월) 정도였다. ELISA 결과에서 결핵환자 A 군의 경우 혼합 항원에 대한 민감도가 90.2%였으며, B 군은 혼합 항원에 대한 민감도가 70.0%였고, C 군은 혼합 항원에 대한 민감도가 75.8%였다. 전체적으로 A, B, C 결핵환자군의 평균민감도는 78.9%였다. 건강대조군은 80명 가운데 2명 이 양성반응을 보여 특이도가 97.5%였으며, 환자 접촉군은 61명중 9명이 양성반응을 보여 특이도가 85.2%로 조금 낮았다. Rapid TB 결과에서 결핵환자 A 군은 혼합 항원에 대한 민감도가 90.2%였으며, B 군은 혼합 항원에 대한 민감도가 77.5%였고, C 군의 경우는 혼합 항원에 대한 민감도가 93.9%였다. 전체적으로 A, B, C 결핵환자군의 평균민감도는 86.8% 였다. 건강대조군은 80명 가운데 2명이 양성 반응을 보여 특이도가 97.5% 였으며, 환자 접촉군은 61명중 5명이 양성반응을 보여 특이도 가 91.8%를 보였다. PCR 진단 결과에서 결핵환자 A 군의 경우는 혼합 항원에 대한 민감도가 68.3%였으며, B 군의 경우는 혼합 항원에 대한 민감도가 47.5%였고, C 군은 혼합 항원에 대한 민감도가 군의 경우 63.6%였다. 전체적으로 A, B, C 결핵환자 군의 평균민감도는 59.6%였다. 건강대조군은 80명 가운데 8명이 양성반응을 보여 특이도가 90.0% 였으며, 환자 접촉군은 61명중 10명이 양성반응을 보여 특이도가 83.6%로 조금 낮았다.
결과를 종합해보면, 최근에 결핵으로 진단 받고 균이 배출되는 결핵환자들의 경우 결핵의 효과적인 퇴치를 위해 결핵환자를 조기에 발견하기 위한 결핵진단 기술의 개발을 목적으로 결핵균의 항원을 다양한 방법을 이용하여 준비하고 r38 kDa 항원등에 다른 항원들을 첨가하여 혼합항원으로 제조된 Rapid TB의 민감도 결과가 86.8%, ELISA TB의 민감도 결과는 78.9%로 현재 임상에서 이용되는 도말, 배양 검사에 혈청학적 진단도 이용된다면 결핵 진단 및 치료에 도움을 줄 것으로 보였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In recent years, Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) infection has re-emerged as a major health problem in the world. So rapid and accurate detection of M. tuberculosis is very important for treatment and respiratory care. Laboratory diagnosis of pulmonary tuberculosis (TB) still relies on detection of M. tuberculosis from sputum specimens from patients clinically compatible with TB. Sputum-smear microscopy for acid-fast bacilli (AFB) and culture of M. tuberculosis have limitations due to low sensitivity, low specificity and long incubation period up to 8 weeks. Recently, therefore, sensitive and specific laboratory diagnostic tests including polymerase chain reaction (PCR) and serological tests have been developed, and some of them are used in clinical mycobacteriology laboratory. During the first stage of the study, several native M. tuberculosis antigens including culture filtrate protein (CFP), lipoarabinomannan (LAM), diacyltrehalose (DAT), and PPD were examined for use in the serodiagnosis of tuberculosis. In overall, the sensitivity of serological test ranged from 60% to 85%, and its specificity from 88% to 93%. In addition, recombinant protein antigens such as r16 kDa, r19 kDa, r23 kDa, and r38 kDa were also evaluated for their sensitivity. The result were similar to those obtained by using the native antigens above and ranged from 16% to 87% in sensitivity and 73% to 100% in specificity. Among the native and recombinant antigens, DAT and r38 kDa antigens look promising for use in the serodiagnosis of tuberculosis. To compare the efficacy of different mycobacterial specific antigen and to assess the applicability of the combination of several different antigens in the diagnosis of tuberculosis, five E.coli derived 14kDa, 16 kDa, 19 kDa, 23 kDa, 38 kDa were evaluated in 400 active pulmonary patient and 100 inactive post-therapy follow up patient and 60 healthy control. The opical densities of ELISA with r14 kDa, 16 kDa, 19 kDa, 23 kDa, 38 kDa were significantly higher in active tuberculosis cases than in healthy controls and those with r16 kDa, 38 kDa were significantly higher in active tuberculosis cases than in inactive post-therapy follow up cases and those of r14 kDa, 16 kDa, 23 kDa, 38 kDa were significantly higher in inactive post-therapy follow up cases than in healthy control. The sensitivity of r14kDa, 16 kDa, 19 kDa, 23 kDa, 38 kDa in active pulmonary patient cases were 95.8%, 95.8%, 91.7%, 89.6%, 93.8%, respectively. The sensitivity and specificity of combination r38 kDa with r16 kDa was 87% and 93.7%.
We also attempted to evaluate a available PCR test, ELISA TB and Rapid TB. Serological and Molecular Diagnostic Tests were performed upon 255 individuals, including 114 tuberculosis patients, 80 healthy group, 61 contact group. Respiratory sputa were obtained from 114 TB patients at National Masan Tuberculosis Hospital. They were divided into 3 groups. All sputa were pretreated with 4% NaOH. After centrifugation, they were stained with Ziehl-Neelsen and cultured on 3% Ogawa media. ELISA TB, serological assays based on the immunodominant complex antigen mixture were employed, and the absorbance was read in 450nm. Rapid TB is a rapid in vitro immunoassay for the detection of antibodies to M. tuberculosis in human serum. Using PCR test, 16S rRNA gene sequence was amplified, and the absorbance (450 nm) was read after hybridization with M. tuberculosis complex specific probe. In TB patients A group, sensitivity of ELISA TB, Rapid TB, PCR test, were 90.2 %, 90.2 %, and 68.3 % respectively. In TB patients B group, sensitivity of ELISA TB, Rapid TB, PCR test were 70.0 %, 77.5 %, and 47.5 % respectively. In TB patients C group, sensitivity of ELISA TB, Rapid TB, PCR test were 75.8 %, 93.9 %, and 63.6 % respectively. In healthy group, specificity of ELISA TB, Rapid TB, PCR test were 97.5 %, 97.5 %, and 90.0 %, and respectively. In contact group, specificity of ELISA TB, Rapid TB, PCR test were 85.2%, 91.8%, and 83.6%, and respectively.
This study showed that three M. tuberculosis diagnostic methods give diverse and different results during the anti-M. tuberculosis treatment and that ELISA TB, Rapid TB, PCR test are rapid and sensitive methods for detecting TB.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• 국문요약 = i
• 목 차 = v
• I. 서 론 = 1
• 1. 결핵발생의 현황 = 1
• 2. 결핵의 진단 = 2
• (1) 도말검사 = 3
• (2) 배양검사 = 4
• (3) 분자생물학적기법 = 5
• (4) 혈청진단 = 5
• 연구목적 = 7
• II. 실험재료 및 방법 = 8
• 1. 결핵균배양 및 항원준비 = 8
• (1) 결핵균의 배양 = 8
• (2) Culture Filtrate Protein(CFP) 항원의 준비 = 8
• (3) Purified protein derivative(PPD) and lipoarabinomannan (LAM) 항원의 준비 = 9
• (4) Diacyltrehalose (DAT) 항원 준비= 9
• 2. 유전자재조합 단백질의 생산 = 9
• (1) E. coli 유전자재조합 단백질의 발현 = 9
• (2) Mycobacteria에서의 항원단백질 발현 = 11
• 3. 결핵균 항원에 대한 항체 검출 = 13
• (1) PPD와 LAM 항원에 대한 항체의 검출 = 13
• (2) ELISA를 이용한 CFP 항원에 대한 항체의 검출 = 14
• (3) DAT 항원에 대한 항체의 검출 = 15
• (4) ELISA를 이용한 유전자재조합 16, 19, 38 kDa 항원에 대한 항체의 검출 = 15
• (5) ELISA TB에 의한 유전자재조합 항원에 대한 항체의 검출 = 16
• (6) Rapid TB에 의한 유전자재조합 항원에 대한 항체의 검출 = 17
• 4. 연구대상환자 = 18
• (1) 결핵환자 = 18
• (2) 비활동성 병력자 = 19
• (3) 환자접촉자 = 19
• (4) 건강대조군 = 20
• 5. 분자생물학적 기법에 의한 결핵균 검출 = 20
• (1) 검체대상 = 20
• (2) 검체의 도말, 배양검사 = 21
• (3) Polymerase Chain Reaction(PCR) 기법 및 양성 기준 = 21
• 6. 통계분석 = 23
• III. 결 과 = 24
• 1. 유전자재조합 단백질의 생산 = 24
• (1) 유전자재조합단백질의 cloning = 24
• (2) 유전자재조합 단백질의 E. coli에서의 발현 = 24
• (3) Mycobacterium-E. coli shuttle vector, pYMC-His로의 subcloning = 29
• (4) Mycobacteria에서의 유전자재조합단백질 발현 = 32
• 2. 결핵균 항원에 대한 혈청진단 결과 = 35
• (1) CFP 항원에 대한 진단 결과 = 35
• (2) PPD 및 LAM 항원에 대한 진단 결과 = 35
• (3) Diacyltrehalose 항원에 대한 진단 결과 = 40
• (4) Recombinant 38 kDa 항원에 대한 진단 결과 = 42
• (5) Recombinant 16 kDa항원과 19 kDa항원에 대한 진단 결과 = 45
• 3. 유전자재조합 항원을 이용한 혈청학적 진단 결과 = 48
• (1) r14 kDa항원에 대한 진단 결과 = 48
• (2) r16 kDa항원에 대한 진단 결과 = 48
• (3) r19 kDa항원에 대한 진단 결과 = 48
• (4) r23 kDa항원에 대한 진단 결과 = 49
• (5) r38 kDa항원에 대한 진단 결과 = 49
• 4. 혼합된 유전자재조합 항원을 이용한 혈청학적 진단 결과 = 51
• (1) 대상군별 ELISA TB에 의한 진단 결과 = 51
• (2) 대상군별 Rapid TB에 의한 진단 결과 = 52
• 5. 분자생물학적 기법에 의한 결핵균 검출 = 52
• IV. 고 찰 = 57
• 참 고 문 헌 = 63
• LIST OF TABLES = 72
• LIST OF FIGURES = 73
• Abstract = 74