Effects of Leptin on Osteoclast Generation and Activity : Leptin이 파골세포의 생성 및 활성에 미치는 영향

국문 초록 (Abstract)

Leptin은 지방세포에서 생성되어 에너지 조절 호르몬으로 시상하부에 작용하며, 그 수용기가 여러 조직에 분포하며, 조혈작용, 면역작용 및 뇌 발달과 같은 여러 작용에 관여한다고 알려져 있다. 또한 leptin과 그 수용기가 조골세포에서 발현되며, leptin이 조골세포의 증식, 교원섬유 합성 및 석회화를 촉진하며, 파골세포의 생성을 억제함이 보고되었다. 따라서 leptin이 골대사에 관여하리라 여겨지나 그 정확한 기전은 알려져 있지 않아, 본 연구에서는 leptin이 파골세포의 생성 및 활성 기전에 미치는 영향을 관찰하였다. 마우스 골수세포를 분리하여 1,25-dihydroxy- cholecalciferol (1,25[OH]2D3) 및 prostaglandin E2 (PGE2)를 처리하여 파골세포의 분화를 유도하였고, receptor activator of NF-kB ligand (RANKL)을 처리하여 RAW264.7 세포로부터 파골세포의 분화를 유도하였으며, 동시에 leptin을 여러 농도로 처리하였다. 또한 leptin이 파골세포의 생성 및 활성에 미치는 효과가 PGE2에 의해 매개되는지 확인하기 위하여 cyclooxygenase 억제제인 indomethacin을 처리하여 그 효과를 확인하고, protein kinase C (PKC)의 활성과 관련되어 있는지 확인하기 위하여 PKC 활성 촉진제인 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)와 PKC 억제제인 H7을 처리하여 그 효과를 확인하였다. 또한 leptin의 파골세포 생성 및 활성에 미치는 영향이 파골세포 생성 억제 인자인 osteoprotegerin (OPG)의 분비에 의한 것인지 확인하기 위하여, 조골세포를 배양하며 leptin을 처리한 후 OPG의 생성량을 측정하여, leptin이 파골세포의 생성 및 골흡수 기전에 미치는 영향을 관찰하였다.
그 결과 leptin은 골수세포로부터 1,25[OH]2D3 및 PGE2에 의해 유도된 파골세포의 생성 및 활성을 억제하였으며, RAW264.7 세포로부터 RANKL에 의해 유도된 파골세포의 생성 및 활성을 억제하였다. Indomethacin은 골수세포로부터 1,25[OH]2D3에 의해 유도된 파골세포의 생성 및 활성을 억제하였으며, leptin은 indomethacin에 의해 매개된 파골세포 생성 및 활성 억제효과에 영향을 미치지 못하였다. PMA는 골수세포로부터 1,25[OH]2D3에 의해 유도된 파골세포의 생성을 억제하였으며, leptin을 첨가한 경우 PMA에 의해 효과가 촉진되었다. H7은 골수세포로부터 1,25[OH]2D3에 의해 유도된 파골세포의 생성에 영향을 미치지 못하였다. Leptin은 조골세포로부터 파골세포 생성 억제 인자인 OPG 생성을 촉진하였다. 이상의 결과 leptin은 파골세포의 생성 및 활성을 억제하며, 골조직 대사의 조절에 관여하는 물질이라 여겨진다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Leptin, the product of the obese gene, is a circulating hormone secreted primarily from adipocytes. Several results suggest that leptin is important mediators of bone metabolism. The present study was undertaken to determine the effects of leptin on anti-osteoclastogenesis using murine precursors cultured on calcium-phosphate coated plates and on the production of osteoprotegerin (OPG) in osteoblastic cells. Additionally, this study examined the possible involvement of prostaglandin E2 (PGE2)/protein kinase C (PKC)-mediated signals on the effect of leptin on anti-osteoclastogenesis to various culture systems of osteoclast precursors. Osteoclast generation was determined by counting tartrate-resistant acid phosphatase positive [TRAP (+)] multinucleated cells (MNCs). Osteoclastic activity was determined by measuring area and number of resorption pits formed by osteoclasts on Ca-P coated plate. The number of 1,25-dihydroxycholecalciferol (1,25[OH]2D3)- or PGE2- induced TRAP (+) MNCs in the mouse bone marrow cell culture decreased significantly after treatment with leptin. The number of receptor activator of NF-kB ligand (RANKL)-induced TRAP (+) MNCs in M-CSF dependent bone marrow macrophage (MDBM) cell or RAW264.7 cell culture decreased significantly with leptin treatment. Indomethacin inhibited osteoclast generation induced by 1,25[OH]2D3 and dexamethasone, however, no significant differences were found in the leptin treated group when compared to the corresponding indomethacin group. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), a PKC activator, inhibited osteoclast generation induced by 1,25[OH]2D3. The number of TRAP (+) MNCs decreased significantly with treatment by PMA at concentrations of 0.01 and 0.1 μM in culture. Leptin inhibited PMA-mediated osteoclast generation. Isoquinoline-5-sulfonic 2-methyl-1-piperazide dihydrochloride (H7) had no effect on osteoclast generation induced by 1,25[OH]2D3. Cell culture treatment with leptin resulted in no significant differences in osteoclast generation compared to the corresponding H7 group. Indomethacin showed no significant effect on TRAP (+) MNCs formation from the RAW264.7 cell line. PMA inhibited TRAP (+) MNCs formation induced by RANKL in the RAW264.7 cell culture. H7 had no effect on osteoclast generation from the RAW264.7 cell line. There was no difference compared with the corresponding control group after treatment with leptin. 1,25[OH]2D3- or PGE2-induced osteoclastic activity decreased significantly with leptin treatment at a concentration of 100 ng/ml in mouse bone marrow cell culture. Indomethacin, PMA, and H7 significantly inhibited osteoclastic activity induced by 1,25[OH]2D3 in mouse bone marrow cell culture. No significant difference was found between the leptin treated group and the corresponding control group. The secretion of OPG, a substance known to inhibit osteoclast formation, was detected from the osteoblasts. Treatment with leptin resulted in significant increases in OPG secretion of osteoblastic cells. Taken these results, leptin may be a regulatory cytokines within the bone marrow microenvironment.

목차 (Table of Contents)

• 국문요약 = ⅰ
• 감사의 글 = ⅲ
• Contents = ⅳ
• Ⅰ. Introduction = 1
• Ⅱ. Materials and Methods = 4
• Ⅲ. Results = 8
• Ⅳ. Discussion = 24
• Ⅴ. Conclusion = 28
• Reference = 30
• List of Figures = 36
• ABSTRACT = 37