서양애기장대 내 Brassinosteroids 전사인자 BZR1에 의한 병 저항성 조절 기작

국문 초록 (Abstract)

식물 호르몬은 미량으로 식물의 생장과 발달을 조절하는 물질이며 다양한 종류의 호르몬이 존재한다. 그 중에서 식물의 유일한 스테로이드 호르몬인 Brassinosteroids (BRs)의 신호전달 과정이 다른 식물호르몬들의 함량을 조절할 가능성이 확인되었다. 이러한 이유로, 본 연구에서는 BR 신호전달 과정에서 전사인자 중 하나인 BZR1을 중심으로 Salicylic acid (SA) 함량 조절과 이를 바탕으로 한 서양애기장대 내 면역 반응 조절에 대한 연구를 진행하였다.
먼저 병원균 감염 시 나타나는 증상을 관찰하여 BZR1 기능을 획득할 경우 식물체의 병 저항성 증가가 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. Bacterial population을 비교한 실험에서도 Col-0에 비해 bzr1-1D의 잎에서 병원균이 잘 살아남지 못하는 것을 확인했다. SA 축적은 중요한 면역신호이기 때문에 병원균 Pst DC3000 감염 전후로 Col-0와 bzr1-1D 기능획득 돌연변이체에서의 내생 SA를 분석하였다. 분석 결과에서 병 감염 전에는 Col-0와 bzr1-1D 돌연변이체에서 내생 SA함량에 큰 차이가 없었지만, 감염 후에는 Col-0에 비해 bzr1-1D 돌연변이체에서 내생 SA 함량이 훨씬 많았다. 이를 통해 BZR1 기능획득이 서양애기장대 내의 병 저항성 증가에 영향을 줄 수 있다고 판단하였다.
bzr1-1D에서 병 감염 시 SA 내생함량이 급격히 증가하는 결과를 바탕으로 BZR1이 SA 생합성유전자의 발현에 영향을 주는 지 확인하고자 했다. qRT-PCR을 이용한 유전자 발현 분석을 수행하였고 Col-0에 비해 bzr1-1D 돌연변이체에서 10배가량 높은 ICS1 유전자 발현량이 나타났다. SA 생합성 유전자 ICS1의 프로모터와 BZR1의 결합을 in vitro와 in vivo에서 확인하기 위해 Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA)와 Chromatin Immunoprecipitation Assay (ChIP)실험을 진행하였다. 그 결과, BZR1이 pICS1의 cis-element에서 BRRE 서열이 포함된 probe에 직접적으로 결합한다는 사실을 확인하였다.
이후 병 감염 시 BZR1에 의해 SAR를 유도하기 위해 일어나는 NPR1과 PRs 유전자의 발현을 확인했다. SA response 유전자인 PRs은 병원균 감염 시, Col-0보다 bzr1-1D에서 높은 발현량을 보였지만, NPR1의 경우에는 반대의 양상을 보이며 0에 가까운 값을 나타냈다. 이 결과를 바탕으로 BZR1에 의한 NPR1-independent 경로가 존재할 가능성을 고려했다. SA 처리 시 BZR1의 발현량이 증가하는 것을 확인하였고 이것은 NPR1-independent 경로의 존재 가능성을 높여주었다. 동시에, SA에 의해 BZR1의 전사가 활성되면 SAR를 유도하는 면역경로가 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
BZR1이 PR 유전자와의 직접적인 결합으로 NPR1-independent 경로를 거치는지 확인하기 위해 EMSA와 ChIP-qPCR을 수행했다. 그 결과 BZR1은 PR5의 BRRE site에 결합하는 것을 알았다.
SA 전사인자이자 PR1의 전사인자인 TGA가 BZR1에 의해 일어나는 면역 반응에서도 역할을 하는지 확인하기 위해 Col-0와 bzr1-1D에서 TGA1의 발현량을 분석했다. 그 결과 병원균 감염 전후로 발현량과 발현 증가 비율이 Col-0와 bzr1-1D에서 거의 유사한 것을 확인했다. In vitro pull down assay를 수행하여 BZR1과 TGA의 결합을 확인했다. 따라서 BZR1은 TGA1과 결합한 상태로 PR5 프로모터에 직접 결합하여 SAR를 유도하는 것으로 생각할 수 있다.
본 연구를 통해 BR 특이적 전사인자인 BZR1이 SA 생합성 유전자의 발현을 촉진시키는 경로와 SA response 유전자의 발현을 촉진시키는 경로를 통해 서양애기장대 내 병 저항성을 조절한다고 생각할 수 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

There are many kinds of plant hormone and they regulate plant growth and development by small amount. Recently, possibility that Brassinosteroids (BRs), steroidal hormone in plants, can regulate biosynthesis of other plant hormones was confirmed. For this reason, this research studied that regulation of endogenous salicylic acid content and plant immune response by BR signal, especially a BR specific transcription factor BZR1.
Observing disease symptom after pathogen inoculation showed that bzr1-1D has higher resistance than Col-0. In bacterial population counting, bzr1-1D showed less colony formation than that in Col-0. SA accumulation in infected bzr1-1D was much higher than Col-0 but there was no big difference between intact plants. These results demonstrated that BZR1 has a function in plant immunity.
To establish whether BZR1 affects the expression of SA biosynthetic genes analysis of qRT-PCR was performed. Bacteria infected bzr1-1D showed 8 times higher expression level of ICS1 than that in infected Col-0. Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA) and Chromatin Immunoprecipitation Assay (ChIP) results showed that BZR1 directly binds to the promoter region of ICS1.
Next, qRT-PCR was performed to analysis expression level of NPR1 and PRs. When plants were infected by pathogen, SA response gene PR1 and PR5 expressed 5 times higher in bzr1-1D than that in Col-0. But NPR1 expression level showed opposite tendency with the result of PRs expression level. BZR1 expression level in SA treated Col-0 also showed that BZR1 can be induced by SA. Binding assay with EMSA and ChIP-qPCR was performed. These results showed BZR1 binds to PR5 directly and additionally demonstrated possibility of NPR1-independent pathway.
Analysis of expression level of TGA1 was performed to confirm whether PR1 transcription factor TGA1 works in the immune response by BZR1. As a result, the expression level and the increase rate of gene expression were similar in Col-0 and in bzr1-1D before and after pathogen infection. And then, BZR1 binding to TGA1 was proved by In vitro Pull Down Assay.
Based on the above results, it can be thought that a BRs specific transcription factor BZR1 induces plant immune response against biotic stress by 2 pathways in Arabidopsis thaliana. The first pathway can be that BZR1 activates SA biosynthesis gene ICS1. And the second is considered to be an NPR1-independent pathway that BZR1 directly regulates SA response gene PR5.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• 1. Brassinosteroids 1
• 2. Salicylic acid 5
• 3. 연구목적 12
• Ⅱ. 재료 및 방법 13
• 1. 식물 재료와 생육 13
• 2. ICS1과 BZR1 protein의 in vitro binding assay (EMSA) 13
• 3. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay 16
• 4. Col-0와 bzr1-1D 돌연변이체에서의 유전자 발현 분석 (qRT-PCR) 21
• 5. 병원균이 감염된 잎에서 total SA 함량 분석 (ELISA) 23
• 6. Bacterial population 측정 25
• 7. PR5 와 BZR1의 결합여부 및 결합부위 확인 25
• 8. In vitro Pull Down Assay 27
• Ⅲ. 결과 29
• 제 1 절 BZR1 의한 Salicylic acid 축적 및 병 저항성 증가 29
• 1. 병 감염 시, Col-0와 bzr1-1D의 저항성 비교 29
• 2. Col-0와 bzr1-1D 내생 SA 함량 분석 30
• 제 2 절 BZR1의 SA 생합성 유전자 조절을 통한 면역 반응 연구 33
• 1. BZR1에 의해 조절되는 SA 생합성 유전자 발현 분석 33
• 2. BZR1의 ICS1 프로모터 결합여부 및 결합부위 확인 35
• 제 3 절 BZR1의 SA responsive 유전자 조절을 통한 면역 반응 연구 40
• 1. BZR1에 의한 SA responsive 유전자 발현 조절 확인 40
• 2. BZR1의 PR5 프로모터 결합여부 및 결합부위 확인 42
• 3. BZR1과 TGAs 사이의 interaction 확인 46
• Ⅳ. 고찰 50
• 참고문헌 55
• 국문초록 59
• ABSTRACT 61