PAC1R isoforms 의 세포내 신호전달 차이 연구 = Study on differences in intracellular signaling of PAC1R isoforms

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide type 1 receptor (PAC1R) 은 G protein coupled receptor (GPCR) 의 일종으로, 뇌 및 신경 조직에서 많이 발현하며, 중추 및 말초 신경계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 뇌혈관 조직이 손상 받게 되면 PAC1R의 활성이 세포의 사멸을 완화하거나 지연시켜 세포 생존을 강화한다. 이러한 조건에서 PAC1R 신호를 강화하는 것은 뇌졸중, 파킨슨병 및 알츠하이머 관련 세포 손상을 완화하는 데 기여할 수 있다. 반면에 PAC1R의 활성이 스트레스 관련 정신병, 편두통, 대사 질환 관련 여러 장애에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 다양한 병리학적 조건에서 PAC1R의 신호를 조절하는 것은 관련 질병을 치료할 수 있는 가능성을 제시한다. 본 연구에서는 신경모세포종 (Neuroblastoma) 조직에서 PAC1R이 특이적으로 Null의 형태가 아닌 HOP (+28) 의 형태로 많이 존재하는 것을 확인하였다. 이는 Null과 HOP의 기능적 차이의 연구를 통해 PAC1R의 isoform이 신경모세포종 치료 및 약물 개발의 표적으로 연구될 수 있음을 의미한다. 세포막에 존재하는 PAC1R에 selective agonist로 작용하는 PACAP27을 처리하였을 때, 세포 내로 internalization이 일어나는 현상을 관찰하였다. 결과적으로, HOP의 internalization이 Null보다 더 많이 일어나고 오래 지속되는 것을 확인하였다. 또한 이러한 internalization 차이를 만드는 데 β-arrestin이 영향을 미친다는 것을 확인하였다. 이에 따라 PAC1R과 β- arrestin의 상호작용에 있어 Null과 HOP이 어떠한 차이를 보이는지 확인하였다. β-arrestin recruitment 정도를 관찰하였을 때, Null에 β- arrestin recruitment가 더 잘 일어나는 것으로 확인되었고, 이는 β- arrestin의 양이 internalization 차이에 영향을 주지 않음을 의미한다. 다음으로 β-arrestin 이 PAC1R에 결합하는 구조적 측면에서 차이가 있는지 확인해보고자 하였다. 이를 위해 “Core conformation”에 필수적인 Finger loop region (FLR) 서열을 제거해 recruitment 정도를 확인해 보았을 때, Null과 HOP에서 β-arrestin 결합 형태에 차이가 나타나지 않았다. 이 결과를 통해 internalization 차이를 만드는 것에는 결합 구조가 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 이후 HOP의 추가적인 ICL3 서열에 β- arrestin이 인식하는 인산화 자리가 존재하는지, 있다면 인산화 효소가 무엇인지 확인하였다. 이를 위해 다양한 인산화 효소에 대해 선택적 억제제를 처리하여 변화되는 internalization을 관찰하였다. 실험을 통해 Phosphokinase C (PKC) 에 의해 PAC1R의 internalization이 가장 크게 영향을 받으며, 이러한 영향은 Null보다 HOP에 더 많이 작용하는 것으로 확인되었다. 이는 HOP의 추가적인 ICL3 서열에 PKC가 상호작용함을 나타낸다. 또한 실험을 통해 PKC가 인산화 하는 자리를 특정하였다. HOP ICL3의 추가적인 28개의 아미노산 중 S350, S353, T354을 선택적으로 변이 시켰을 때, HOP의 internalization이 크게 감소함을 확인하고, 이 인산화 자리가 β-arrestin의 활성화에 영향을 미쳐 Null과 HOP의 internalization 차이를 만든다는 사실을 확인하였다. 본 연구의 결과는 Null과 HOP의 세포내 신호전달 차이가 주로 β- arrestin에 의한 internalization에 기인하며, 이것을 일으키는 구체적인 메커니즘을 밝힘으로써 작용 기전에 대한 이해를 높이는데 의의가 있다. 이와 더불어 신경모세포종에 대한 잠재적 치료 방법 연구에 기여할 수 있음을 제시하고 있다. 또한 신경모세포종에 대해 PAC1R isoform을 표적으로 연구가 이루어질 수 있는 새로운 가능성을 제시한다. 주요어 : Null, HOP, β-arrestin, Internalization, PKC, Phosphorylation site 학 번 : 2022-20783

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Type 1 Receptor (PAC1R) is a G protein coupled receptor (GPCR) predominantly expressed in the brain and neural tissues, playing a crucial role in both the central and peripheral nervous systems. Activation of PAC1R has been shown to mitigate or delay cell death in brain vascular tissues, suggesting its potential to alleviate cell damage associated with conditions such as stroke, Parkinson’s disease, and Alzheimer’s disease. Conversely, dysregulation of PAC1R activity may influence disorders related to stress, migraines, and metabolic dysfunctions. Therefore, the modulation of PAC1R signaling in various pathological conditions presents an opportunity for potential disease treatment. In general tissues, the prevalence of the Null form surpasses that of the HOP form. Notably, our research has identified an elevated expression of the HOP form relative to the Null form in neuroblastoma tissues. This observation holds considerable significance for investigating the difference of Null and HOP isoforms, which can contribute to the development of treatment of neuroblastoma.
Upon treating PAC1R on the cell membrane with the selective agonist PACAP 27, we observed internalization in the cells. Importantly, we found that HOP exhibits more extensive and prolonged internalization compared to Null, and identified the involvement of β-arrestin in mediating this internalization difference. Moreover, analyzing the interaction between PAC1R and β-arrestin revealed that β-arrestin recruitment is more efficient in Null, indicating that the quantity of β-arrestin does not solely account for the observed internalization difference. Subsequent investigation into the structural aspects of β-arrestin binding did not reveal differences between Null and HOP, suggesting that binding structures do not impact the internalization disparity either.
Further analysis focused on determining whether β-arrestin recognizes additional sequences in HOP. Treatment with various phosphorylation enzyme inhibitors revealed that PKC significantly influences PAC1R internalization, with the noteworthy observation that HOP exhibits greater susceptibility to PKC compared to Null. Subsequent identification of phosphorylation sites indicated that S350, S353, and T354 within the additional 28 amino acids of HOP play a pivotal role in internalization. Mutating these phosphorylation sites resulted in reduced HOP internalization, underscoring the substantial contribution of these sites to β- arrestin activation and subsequent internalization.
In summary, this research elucidates the disparity in internalization between Null and HOP isoforms of PAC1R and unveils a specific mechanism underlying this distinction. This understanding advances our comprehension of the functional mechanisms and, in conjunction with the prevalence of HOP in neuroblastoma tissues, implies the potential for isoform-targeted research in the context of neuroblastoma.

목차 (Table of Contents)

• 초 록 1
• 목 차 3
• 표 및 그림 목차 . 4
• 줄임말 정리 5
• Ⅰ 서 론 6
• Ⅰ-1 GPCR 의 신호전달: G protein & β-arrestin 6
• Ⅰ-2 PAC1R 의 특성 8
• Ⅰ-3 연구 목적 및 의의 10
• Ⅱ 재료 및 방법 11
• Ⅲ 결 과 17
• III-1 PAC1R isoforms 의 internalization 차이 . 17
• III-2 β-arrestin 과의 상호작용 차이 24
• III-3 PAC1R isoform 에 작용하는 인산화 효소와 서열 29
• Ⅳ 논 의 34
• 참고문헌 . 37
• Abstract 39
• 4