창상치료를 위한 세포치료제의 개발 및 화상시험법 확립 = Development of Cell Therapy for Wound Healing and Experimental Burn Methods

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study was described in five chapter: lecture review, composite skin equivalents for wound healing, multi-phase cell carriers, ASCs differentiation into keratinocytes, and experimental burn methods for the study of burn healing. The first chapter involved a lecture review of tissue engineering and wound healing and a general description of ASCs. The second and third parts described medicines developed for skin wound healing.
Chapter 2
Application of a Composite Skin Equivalent using Collagen and Acellular Dermal Matrix as the Scaffold in a Mouse Model of Full-thickness Wound.
The aim of this study was to develop a composite human skin equivalent for wound healing. Collagen type1 and acellular dermal matrix powder were utilized as the scaffold with dermal fibroblasts and keratinocytes for the development of a composite human skin equivalent. Fibroblast maintained the volume of composite skin equivalent and also induced keratinocytes to attach and proliferate on the surface of composite skin equivalent. The composite human skin equivalent had a structure and curvature similar to those of real skin. Balb-C nu/nu mice were used for the evaluation of full-thickness wound healing effect of the composite human skin equivalent. Graft of composite skin equivalent on full-thickness wound promoted re-epithelialization and granulation tissue formation at 9 days. Given the average wound-healing time (14 days), the wound in the developed composite skin equivalent healed quickly. The overall results indicated that this three-dimensional composite human skin equivalent can be used to effectively enhance wound healing.
Chapter. 3.
The application of a multi-phase cell carrier using plasma polymerized surfaces as the scaffold in a mouse model of full-thickness wound.
The aim of this study was to develop a cell carrier system for delivery of skin cell to promote wound healing in full thickness wound. We utilized Plasma polymer surface containing 20% carboxylic acid as the cell carrier with human keratinocyte and fibroblast for the development of a multi-phase cell carrier system. Attachment cell morphology and cell migration aspect was observed by scanning electron microscopy. Balb-C nu/nu mice were used for the evaluation of full-thickness wound healing effect of the cell carrier. Graft of cell carrier on full-thickness wound promoted re-epithelialization and granulation tissue formation at 12 days. Given the average wound-healing time (14 days), the wound in the cell carrier healed quickly. The overall results indicated that this cell carrier can be used to effectively enhance wound healing.
Chapter. 4
Differentiation of adipose stem cell into keratinocyte in vitro.
Adipose tissue contains a large number of adult stem cells(Adipose stem cells:ASCs) with multipotent properties suitable for tissue engineering and regenerative medical applications. ASCs are a heterogeneous population of cells that proliferate in vitro as plastic-adherent cells, have fibroblast-like morphology, form colonies in vitro and can differentiate into mesoderm such as bone, cartilage and fat cells. Recent studies have shown that ASCs can be differentiated into ectoderm lineages. For ASC differentiation, epidermal growth factor and serum-free keratinocyte media were applied to the fibroblast co-culture. As a result, typical surface antigen KRT14 expression of keratinocytes was confirmed. In addition, the high pure isolation was proven using MACs. The completely differentiated cells confirmed not only keratinocyte markers but also weaker ASCs markers. Therefore, it was expected that the allotype-cell therapy medicine would be developed using the ASCs differentiation method.
Chapter. 5
Development of the experimental burn methods for induction of progressive burn depth.
It is not easy to control and measure the burn depth on in vivo burn model, because burn depth induced by experimental burn depends on the burning method, skill of the experimentor and thickness of the skin. Furthermore, there is little agreement on the method for measuring burn depth. The objective of this study was to develop a standard method for inducing in vivo burn. The induction of burn on the skin of SD rat using three burning methods such as 100℃water, gas torch flame, and hot iron was compared. Hot iron burning method was found to give the linear burn depth when compared with 100℃water or gas torch flame methods at the same application time. The hot iron method (i.e., 100℃ iron) induced a reproducible burn. Furthermore, the feasibility of the burn-induction methods was confirmed for application in research and medical evaluations.

국문 초록 (Abstract)

본 논문은 창상치료를 위한 혼합형 인공피부, 실리콘 cell carrier, 지방줄기세포의 각질세포로의 분화 그리고 화상치료 및 연구를 위한 화상유발법 확립에 관한 내용으로 총5부분으로 작성되었다. 1부 에서는 조직공학, 창상치료 그리고 지방줄기세포에 관한 일반적인 내용을 서술 하였다.
2부의 내용은 피부 구성물 중 가장 많이 존재하는 1형 콜라겐을 기본으로 한 창상치료용 인공피부를 개발한 것으로 사람 피부에서 채취한 피부세포와 분쇄한 무세포진피를 적용해 개발하였다. 피부세포는 각질세포와 섬유아세포로 각각 피부의 상피와 진피층에 존재하며 구조 유지 및 창상 치료를 담당한다. 피부세포를 1형 콜라겐으로 제작한 인공피부와 혼합 했을 때 섬유아세포는 인공피부의 부피를 유지하였고 각질세포가 인공피부 표면에서 부착 및 생장이 되도록 유도해 실제 피부와 동일한 구조를 보였다. 분쇄 무세포진피를 인공피부의 진피층에 첨가 후 단면을 확인한 결과 실제 피부와 유사한 구조 및 굴곡을 나타냈다. 치료능을 평가하기 위해 동일한 방식으로 콜라겐 대신 피브리노겐을 사용해 피브린 타입 인공피부를 제작하였다. 콜라겐 인공피부는 9일만에 인공창상의 재상피화를 유도했으며 이는 일반적인 창상치료 기간인 14알보다 빠른 결과이다.
3부는 각질세포를 기본으로 한 창상세포치료제의 개발을 서술하였다. 기존의 각질세포치료제는 창상에 적용후 드레싱 및 시술자의 숙련도에 따라 재현성 없는 치료효과를 나타냈다. 또한 진피형성 전에 각질세포를 처리하여 치료 성공율이 낮았다. 이러한 단점을 해결을 위해 실리콘 cell carrier 에 각질세포와 섬유아세포를 각각 배양 하였으며, 창상부의 진피형성을 위해 섬유아세포를 적용한 후 각질세포를 적용하는 방식의 치료법을 개발 하였다. 인공창상에 적용한 결과 단일세포를 적용한 케이스에 비교해 빠른 창상치료효과가 나타났으며 실제 피부와 유사한 구조로 리모델링되었다.
4부는 줄기세포를 활용해 창상치료 및 자유로운 조직, 기관 재생연구의 기반을 다지기 위해 지방줄기세포 분화를 연구하였다. 일반적으로 중배엽 기원인 지방줄기세포를 같은 배엽 기원인 지방, 근육, 연골, 뼈 등으로 분화를 유도한 연구는 활발하게 진행되었으나 배엽을 넘어선 분화는 아직 많은 연구가 이루어지지 않았다. 분화유도를 위해 지방줄기세포와 섬유아세포의 혼합배양, 상피생장인자와 각질세포전용 무혈청배지를 적용하였다. 그 결과 분화물에서 각질세포의 대표적인 표면 항원인 KRT14 의 발현을 확인 하였으며 MACs 를 활용한 순도 높은 분리도 가능함을 증명하였다. 특이하게도 분화가 완료된 세포에서 각질세포의 특이적 항원뿐만 아니라 약하지만 지방줄기세포의 특이적 항원도 나타났다. 완벽한 분화법 개발 및 분화 후 남은 줄기세포의 특징이 끼치는 재생의학적 가능성의 연구가 필요할 것으로 사료된다.
5부는 인공화상을 유발한 동물모델을 개발한 내용을 서술하였다. 인공화상 유발은 인공창상에 비교해 재현성이 현저하게 떨어져 피부결손 치료제를 개발할 경우 대부분 창상 중심으로 연구가 이루어지며 임상수탁기관에서도 화상치료 검증관련 모델이 없는 경우가 많은 실정이다. 재현성 있는 인공화상 유발을 위해 인두, 열수, 화염 법을 비교해 화상 유발법을 확립하였으며 100℃인두로 1도, 2도, 3도 화상을 재현성 있게 유발시킬 수 있었다. 또한 화상조직의 자연치유, 세포치료제 적용을 통해 연구 및 치료제 평가용 인공화상유발법으로서의 가능성을 확인 하였다.

목차 (Table of Contents)

• 1. 서론 1
• 1.1. 조직공학 1
• 1.2. 조직공학제제 시장 및 현황 3
• 1.3. 창상치료 6
• 1.3.1. 창상치료 방법 6
• 1.3.1.1. 자가조직기술 6
• 1.3.1.2. 무세포진피기술 7
• 1.3.1.3. 이식용 세포지지체 활용기술 9
• 1.3.1.3.1. 콜라겐 9
• 1.3.1.3.2. Fibrin glue 9
• 1.3.1.4. 인공피부기술 13
• 1.3.1.5. 세포이동을 위한 지지체 활용기술 13
• 1.4. 화상치료 14
• 1.5. 지방줄기세포의 조직공학적 적용 16
• 1.5.1. 지방과 지방줄기세포 16
• 1.5.2. 지방줄기세포의 분화 16
• 1.5.3. 조직공학적 적용 17
• 1.6 본 연구의 목적 17
• 1.6.1. 혼합형 인공피부의 개발 및 효능검증 18
• 1.6.2. 세포이동 시스템 18
• 1.6.3. 지방줄기세포의 각질세포 분화연구 18
• 1.6.4. 인공화상 동물모델 개발 19
• 1.7. 참고문헌 20
• 2. 콜라겐과 무세포진피를 이용한 혼합형 인공피부 개발 및 쥐 모델에서 창상치료능 확인
• 2.1. 서론 30
• 2.2. 재료 및 방법 32
• 2.2.1. 섬유아세포와 각질세포의 분리 및 초대배양 32
• 2.2.2. 1형 콜라겐에 대한 섬유아세포와 각질세포의 안정성 확인 33
• 2.2.3. in vitro 창상치료능 시험 33
• 2.2.4. 인공피부 제작- 34
• 2.2.4.1. 1형 콜라겐과 무세포진피를 이용한 혼합형 인공피부 제작 34
• 2.2.4.2. 피브린과 무세포진피를 이용한 혼합형 인공피부 제작 35
• 2.2.5. in vivo 창상치료 효과시험 35
• 2.2.6. 창상면적 측정 36
• 2.3. 결과 및 고찰 36
• 2.3.1. 1형 콜라겐에 대한 섬유아세포와 각질세포의 안정성 36
• 2.3.2. 1형 콜라겐의 in vitro 창상치료 효과 39
• 2.3.3. 1형 콜라겐과 무세포진피를 이용한 혼합형 인공피부 제작 41
• 2.3.4. 1형 콜라겐과 무세포진피를 이용한 혼합형 인공피부의 in vivo 창상치료 효과 43
• 2.4. 참고문헌 50
• 3. Plasma Polymerized Surfaces을 이용한 Multi-phase Cell Carrier System 개발 및 창상치료능 확인
• 3.1. 서론 53
• 3.2. 재료 및 방법 56
• 3.2.1. 섬유아세포와 각질세포의 분리 및 초대배양 56
• 3.2.2. 실리콘-Carboxylic acid 중합필름을 이용한 Cell carrier 제조 56
• 3.2.3. 피부세포 창상부착 in vitro 확인 57
• 3.2.4. 실리콘 cell carrier의 세포생존시간 측정 57
• 3.2.5. 실리콘 cell carrier 적용 모델별 창상 치료능 확인 58
• 3.2.6. 창상면적 측정 58
• 3.3. 결과 및 고찰 59
• 3.3.1. 세포부착능 확인 59
• 3.3.2. 각질세포 배양 유지한계 확인 62
• 3.3.3. 실리콘 cell carrier 창상 치료능 64
• 3.4. 참고문헌 71
• 4. 지방줄기세포(ASCs)의 각질세포분화 연구
• 4.1. 서론 75
• 4.2. 재료 및 방법 76
• 2.2.1. 섬유아세포와 각질세포의 분리 및 초대배양- 76
• 4.2.2. 지방줄기세포의 초대배양 76
• 4.2.3. 지방에서 추출한 줄기세포의 유세포 분석 77
• 4.2.4. 각질세포 분화 77
• 4.2.5. 면역세포화학염색 78
• 4.2.6. 분화된 각질세포 분리 78
• 4.2.7. 분리된 각질세포 확인 79
• 4.3. 결과 및 고찰- 82
• 4.3.1. 지방줄기세포의 유세포 분석 82
• 4.3.2. 지방줄기세포의 배양한계 확인 84
• 4.3.3. 지방줄기세포의 각질세포 분화 87
• 4.3.4. 지방줄기세포의 각질세포 분화법 확인 89
• 4.3.5. 분화된 각질세포의 PCR 검증 91
• 4.4. 참고문헌 96
• 5. 화상치료제 전임상을 위한 단계별 화상유발법 확립
• 5.1. 서론 100
• 5.2. 재료 및 방법 101
• 5.2.1. 시험적 화상유발 101
• 5.2.1.1. 화염 101
• 5.2.1.2. 인두 102
• 5.2.1.3. 열수 102
• 5.2.2. 화상 조직검사 104
• 5.2.3. 화상 깊이측정 104
• 5.2.4. 유발된 화상의 세포치료 104
• 5.3. 결과 및 고찰 105
• 5.3.1. 화상의 육안관찰 105
• 5.3.2. 화상 조직검사 및 깊이 측정 107
• 5.2.3. 인두로 유발한 3도 화상 동물모델의 검증 110
• 5.2.4. 유발된 화상의 세포치료 115
• 5.4. 참고문헌 119
• 요약 122
• Abstract 124