Characterization of Seed Traits of 13 kDa Prolamin Gene-Edited Rice Lines Generated by CRISPR/Cas9 = 벼에서 CRISPR/Cas9 으로 생성된 13 kDa 프롤라민 유전자 편집 라인의 종자 특성 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Rice seed storage protein is a key nutrient component, providing essential amino acids crucial for human nutrition and a nitrogen source for developing plant seedlings. Prolamin, accounting for 20-30% of the total seed storage proteins, accumulates in ER-derived protein bodies (PB-I). Prolamins are categorized into three groups by molecular size (10, 13, or 16 kDa), while the 13 kDa prolamins are assigned to four subgroups (Pro13a-I, Pro13a-II, Pro13b-I, and Pro13b-II) based on cysteine residue content. Here, we generated four knockout strains of rice using CRISPR-Cas9, named 1a-8-1, 2a-2-1, 4b-9-7, and 8b-3-9, each of which demonstrated selectively reduced expression of specific subgroups of the 13 kDa prolamins (Pro13a-I, Pro13a- I, Pro13b-I/II, and Pro13b-I, respectively). These four mutant rice lines also showed the compensatory expression of glutelins and non-targeted prolamins and were accompanied by low grain weight, altered starch content, and atypically-shaped starch granules and protein bodies. Transcriptome analysis identified 927 transcripts that were differentially expressed in the mutant rice lines during development. Subsequently, a Pearson correlation analysis was conducted among 927 DEGs and 13 kDa prolamin genes, revealing 746 transcripts with a correlation coefficient of ≥|0.7|. A correlation network was established, involving transcripts mainly associated with RNA processing, RNA transcription, protein synthesis, protein folding, protein degradation, protein targeting, protein posttranslational modification, stress response, and transport functions. Analysis of this network revealed a negative correlation between genes in the Pro13a-I subgroup and those in the Pro13a-II and Pro13b-I/II subgroups. Moreover, the alterations in the transcription levels of 9 ER stress and 17 transcription factor genes was also observed in mutant rice in which expression of 13 kDa prolamin genes was suppressed. Our results provide valuable insight into the regulatory mechanisms underlying rice seed development and the specific roles played by 13 kDa rice prolamins and their target genes.

국문 초록 (Abstract)

프롤라민 (Prolamin)은 인간의 중요 영양소인 필수 아미노산 공급원과 종자 발아를 위한 질소원으로 이용되는 벼 종자 저장단백질의 20~30%를 차지하는 단백질로 세포내 소포체 (Endoplasmic Reticulum)로 부터 유래된 단백질체 (Protein Body-I) 소기관에 축적되어 있다. 프롤라민은 분자량에 따라 3개 그룹 (10, 13, 16 kDa)으로 나누어 지고, 13 kDa 프롤라민의 경우 아미노산 서열 상동성과 cysteine 아미노산 수에 따라 4개 서브그룹 (Pro13a-I, Pro13a-II, Pro13b-I, Pro13b-II)으로 구분된다. 본 연구에서 CRISPR-Cas9 시스템을 활용하여 13 kDa 프롤라민의 특정 서브그룹 (Pro13a-I, Pro13b-I, Pro13b-I/II)의 함량을 선택적으로 감소시킨 프롤라민 유전자 knockout (KO) 벼 4 계통 (1a-8-1, 2a-2-1, 4b-9-7, 8b-3-9)을 생산하였다. 프롤라민 유전자 KO 벼 4계통에서 글루텔린과 비표적 프롤라민 유전자의 보상적 발현 증가, 곡물 중량 저감, 전분 함량 변화 및 전분 과립과 단백질체 모양의 비정형이 관찰되었다. 전사체 분석을 통해 종자 발달 과정에서 프롤라민 KO벼 4 계통에서 전체 927개의 DEG (Differentially Expressed Gene)가 확인되었고, DEG와 13 kDa 프롤라민 유전자 사이의 Pearson 상관 분석을 수행하여 상관 계수가 ≥|0.7|인 746개의 유전자를 밝혀냈다. 이들 중 RNA 처리과정/전사, 단백질 합성/folding/분해/표적화/번역 후 변형, 스트레스 반응 및 수송에 관여하는 유전자들과 프롤라민 유전자들과의 correlation network 분석 결과 Pro13a-I 하위 그룹의 프롤라민 유전자들과 Pro13a-II 및 Pro13b-I/II 하위 그룹의 유전자들 사이에 음의 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 또한 13 kDa 프롤라민 유전자 KO 벼 종자에서 ER 스트레스 관련 유전자 9개 와 전사조절인자 유전자17개에서 발현 변화가 관찰되었다. 이러한 결과는 벼 종자 발달 조절 메커니즘의 기초와 13 kDa 프롤라민 표적 유전자가 수행하는 특정 역할에 대한 귀중한 정보로 활용될 수 있을 것이다.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT 1
• 1. INTRODUCTION . 3
• 2. MATERIALS AND METHODS 12
• 2.1 Design of sgRNA 12
• 2.2 Cloning CRISPR-Cas9 vector and Agrobacterium- mediated generation of 13 kDa prolamin-knockout rice plants 17
• 2.3 Screening transgenic rice plants 21
• 2.4 RNA isolation and qRT-PCR 23
• 2.5 Total seed storage protein extraction, SDS- PAGE, and Western blot analysis . 27
• 2.6 SSP fractionation 27
• 2.7 Measurement of rice agronomic traits, starch content, and germination test 28
• 2.8 Microscopic analysis 28
• 2.9 RNA sequencing . 29
• 2.10 Transcriptome analysis and network visualization 29
• 3. RESULTS 31
• 3.1 Design of sgRNAs for targeting 13 kDa prolamin genes using CRISPR- Cas9 technology . 31
• 3.2 Generating and characterizing 13 kDa prolamin-knockout rice 36
• 3.3 Target gene expression at transcriptional and translational levels 43
• 3.4 Morphological features of 13 kDa prolamin-knockout plants 46
• 3.5 Protein body formation and SSP composition in 13 kDa prolamin- knockout lines . 55
• 3.6 Identification of DEGs in immature seeds of 13 kDa prolamin- knockout plants 60
• 3.7 Correlation network involving DEGs and 13 kDa prolamins 65
• 3.8 Analysis of Endoplasmic Reticulum pathway genes 81
• 3.9 Role of transcription factors in regulating 13 kDa prolamin correlation network . 85
• 4. DISCUSSION 88
• 4.1 Morphological differences between starch granules in WT and 13 kDa prolamin-knockout rice plants 88
• 4.2 Abnormal PB-I morphology in 13 kDa prolamin-knockout plants . 89
• 4.3 Functional analysis of genes correlated with 13 kDa prolamin genes . 91
• 4.4 CRISPR-Cas9's influence on mRNA levels through NMD mechanisms 95
• 4.5 Delay in the seed germination of Pro13b-I/II-knockout lines . 97
• 5. REFERENCES . 98
• ABSTRACT IN KOREAN . 112