트레드밀 운동이 비만 쥐 혈관 내피세포의 오토파지 및 혈관기능 개선에 미치는 효과

국문 초록 (Abstract)

연구목적.
비만이 혈관 세포의 NO 생산을 저하시키고, 산화적 스트레스와 염증반응을 증가시켜 혈관 기능의 감소 및 동맥 경화와 같은 심혈관 질환을 유발한다는 사실은 수없이 많은 선행 연구들에 의해 잘 밝혀져 있다. 그러나 비만으로 인해 유발되는 혈관기능 저하에 대한 명확한 분자생물학적 기전에 대한 연구는 여전히 진행 중에 있으며, 비만에 의한 심혈관 질환에 대한 고민은 여전히 해결되지 않은 현대인의 건강 문제로 그 중요성이 강조되고 있다. 세포 내 자가소화작용을 의미하는 오토파지는 외부의 스트레스 또는 자극에 반응하여 세포질 내에서 정상적인 기능을 하지 못하거나 손상된 세포소기관을 분해하여 재활용 또는 소멸함으로써, 세포의 에너지 대사와 산화·환원 반응을 정상적으로 유지하는 기능을 담당한다. 정상적인 혈관 기능의 항상성을 위해 오토파지는 필수적인 기전으로 보고되고 있으나, 비만이 혈관 세포의 오토파지 기능 저하를 유발하는지의 여부에 대해서는 여전히 잘 알려지지 않은 실정이며, 유산소성 운동 훈련을 통한 비만인 혈관기능의 개선에 있어서 오토파지가 어떠한 역할을 담당하는지에 대한 기전연구 역시 거의 전무한 실정이다. 또한 오토파지의 기능 변화가 혈관의 내피세포가 존재하는 intimal layer와 혈관의 평활근세포가 존재하는 media+adventitia layer 중, 어느 조직에서 특이적으로 나타나는지에 대한 정보도 존재하지 않으며, 오토파지의 기능이 경동맥과 같은 몸통 혈관과 장골동맥과 같은 하지 혈관 중 특정 위치에 따라 특이적으로 나타나는지에 대한 정보 역시 전무하다.
본 연구에서는 비만이 혈관 세포의 오토파지에 어떠한 영향을 미치는지를 파악하고, 비만 혈관의 오토파지 개선을 통한 혈관 기능 향상에 있어서 유산소성 운동이 어떠한 영향을 미치는지를 혈관의 내피세포층과 평활근세포층으로 구분하여, 경동맥과 장골동맥에서의 결과를 각각 비교·규명함으로써, 비만인의 심혈관 질환 예방과 개선을 위한 기초자료를 제공하는 데 그 목적이 있다.

연구내용 및 방법.
- 실험동물 및 트레드밀 운동. 5주령의 수컷 C57BL6 마우스는 12주간 각 30마리씩 일반 식이와 고지방 식이를 실시하여, 고지방 식이를 실시한 30마리에게 비만을 유발한다. 각 그룹별(통제군, 운동군, 비만군, 비만운동군)로 15마리씩 무선할당 후, 사전 측정을 위해 각 그룹별로 7마리씩 희생하고, 혈관조직을 샘플링 한다. 이후, 일일 1시간, 주 5회, 10주간 운동군과 비만운동군은 트레드밀 운동을 실시한다. 운동 빈도는 주 5회, 총 10주간 실시하고, 사후에 각 그룹별 8마리씩 희생하여 혈관조직을 샘플링 한다.
- 조직처리. 마취된 쥐의 흉강을 열고 대동맥, 좌·우 경동맥과 좌·우 장골동맥을 샘플링 한다. 전체 대동맥은 단백질 발현량 측정에 필요한 immunoblotting을 위해 저장된다. 좌측 경동맥과 좌측 장골동맥은 혈관의 Intima 층을 형성하는 내피세포와 Media+Adventitia 층을 형성하는 평활근 세포의 분리를 위해 QIAzol Lysis Reagent를 인슐린 주사기를 이용하여 혈관 내에 주입하여 내피세포를 용해·분리해내고, 나머지 부분 즉, 평활근 세포는 별도로 구분하여 저장한다. 좌측 경동맥과 장골동맥 내피세포와 평활근세포 샘플은 차후 mRNA 발현량 측정을 위한 qRT-PCR을 위해 사용된다. 우측 경동맥과 장골동맥은 NO 생산량 측정을 위한 Nox assay를 위해 저장한다.
- Immunoblotting(Western-blot). 추출된 대동맥은 RIPA lysis buffer에서 균질화 과정을 거친다. 이후 Tris-glycine SDS 전기영동 처리하여, Immobilon-P PVDF membrane에 단백질 샘플을 이동시키고, ECL solution을 이용하여 단백질 발현량을 나타낸다. 단백질 밴드의 밀도는 Image J 소프트웨어를 사용하여 분석한다.
- qRT-PCR. 추출된 mRNA는 QuantiTect Reverse Transcription Kit을 이용하여 cDNA로 합성한다. qPCR은 SYBR green qPCR kit와 cDNA, 각각의 유전자의 forward와 reverse primer mix를 DNase/RNase free water에 혼합하여 실시한다.
- Nox assay. 추출된 우측 경동맥과 장골동맥은 균질화 후, 초원심분리 및 10-30 kDa 울트라 필터를 통해 필터링 한다. 최종 샘플은 Nitrate/Nitrite assay buffer, Nitrate reductase enzyme, Nitrite reductase enzyme이 포함된 solution kit을 이용하여, 96-well 플레이트에서 분광분석기로 assay를 실시한다.