Development of protein arrays for validating serological biomarkers and monitoring enzyme activities : 혈액 biomarker의 검증 및 효소 활성도 분석을 위한 단백질 칩 개발

국문 초록 (Abstract)

마이크로 어레이 기술은 고속으로 대량의 시료를 분석할 수 있는 기술로써, 단백질체학과 혈청학적 진단에 필요한 기술 중에 하나이다. 따라서, 본 연구에서는 혈청 biomarker의 검증, 단백질 분해 효소의 활성도 분석 그리고 혈액 내 protein kinase A (PKA)의 활성도 분석을 위한 새로운 마이크로 어레이 기술의 개발에 관한 내용을 시사한다. 첫번째로, 항체 어레이 데이터 분석시 실험적인 오차를 최소화하기 위해 median-centering 방법과 TIS 분석에 의한 혈청 내 IgM 농도를 이용하여 median-centered/IgM-tagged-internal standard (TIS) assay 표준화 방법을 개발하였다. 먼저 정상 (n = 25)과 간경화 (n = 25), 간암 (n = 29) 그룹으로부터 얻은 혈청 샘플에서 6종류의 혈청 단백질을 분석하기 위하여 5종류의 표준화 방법을 평가하였다. 평가방법은 상관계수와 변동계수를 이용하여 평가하였다. 그 결과, IgM을 이용한 표준화 방법은 변동계수의 향상을 가져왔고, median-centered 표준화 방법은 상관계수의 향상에 효과가 있었다. 또한, 혈액 내 IgM을 분석하기 위해 분석법을 비교해본 결과, TIS assay는 ELISA 방법에 비해 효과적이고 경제적이며 재현성이 있다는 결과를 얻었다. 이를 바탕으로 median-centered/IgM-TIS assay 방법을 이용하여 6종류의 혈액 단백질을 분석한 항체 어레이 데이터를 표준화 하였고, 표준화된 fluorescence intensity의 distribution 분석법을 이용하여 혈액 biomarker의 평가와 ROC 분석법을 이용하여 간경화와 간암을 진단하였다. 진단결과, Apolipoprotein A-1은 간경화 biomarker, alpha-fectoprotein과 CRP 복합은 간암의 혈액 biomarker로써 가능성이 있음을 알 수 있었다. 따라서, median-centered/IgM-TIS assay 표준화 방법은 항체 어레이 데이터의 분석과 간질환 및 암 진단 혈액 biomarker의 평가를 위한 유용한 표준방법이다.
두번째로, 단백질 분해효소 활성도의 실시간 정량 분석을 위해 유리기질로부터 액체상으로의 위상전위를 이용한 펩타이드 어레이를 개발하였다. 펩타이드 어레이는 두 기능을 가진 cross-linker인 GMBS와 C-와 N-말단에 각각 cysteine과 TAMRA를 가진 펩타이드 기질을 이용하여 제작하였다. 위상전위를 이용한 펩타이드 어레이는 MMP-3에 의해 유리기질로부터 분해된 펩타이드의 분석을 통해 입증하였다. 본 연구는 성공적으로 MMP-3의 단백질 분해 활성도를 분석하였다. 또한, MMP-3 활성도에 의해 분해된 펩타이드의 농도 분석을 통해 Km, Vmax 그리고 IC50 상수를 도출하였다. 따라서, 본 연구에서 개발된 펩타이드 어레이는 단백질 분해 효소의 kinetics 정량 분석과 약물 개발을 위한 kinetics 정보 제공에 적절하다.
세번째로, PKA 활성도 분석을 위해 형광 인산화 센서를 이용한 펩타이드 어레이를 개발하였다. 본 연구에서는 혈액 내 PKA 활성도와 자가항체 농도를 분석하기 위해 PKA 기질인 kemptide와 cPKA 에레이를 사용하였다. PKA 활성도 분석 칩의 민감도는 Trion X-100에 의해 0.01 U/ml로 증가하였고 PKA 억제제인 PKI에 의해 PKA 활성도가 억제되었으며 0.5 ?M에서 최고의 억제효과를 볼 수 있었다. 또한, 정상 (n = 30)과 간암 (n = 30), 위암 (n = 30), 폐암 (n = 30) 그리고 대장암 (n = 30) 환자 그룹에서 얻은 혈청에서 sPKA 활성도와 자가항체를 분석한 결과, sPKA 활성도 분석에서 암 그룹에 대해 90%의 민감도와 90%의 특이도, 0.966 AUC 그리고 3.5 U/ml의 cutoff value를 얻을 수 있었다. 그러나, PKA 자가항체 농도 분석 결과, 정상과 암 그룹과의 차이를 볼 수 없었고, sPKA 활성도와 자가항체 농도가 상관관계가 없음을 알 수 있었다. 따라서, sPKA 활성도가 자가항체보다 암 진단을 위한 biomarker로써 가능성이 있음을 알 수 있었고, sPKA 활성도 분석 칩이 암 진단과 PKA에 관련된 질환 진단에 효과적인 분석법임을 시사하는 바이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Microarray technology is a one of the key technology in proteomics and serodiagnosis because this technology is appropriate for the large-scale and high-throughput analysis. In this paper, we developed novel microarrays for validating serological biomarkers, monitoring proteolytic enzyme activity, and analyzing serological protein kinase A activity. First, we developed a novel median-centered/IgM-tagged-internal standard (TIS) assay normalization using median-centering and TIS assay-based determination of serum IgM concentrations for minimizing systemic experimental variation in the analysis of antibody array data. We evaluated five normalization methods by analyzing correlation coefficients and coefficients of variation for six serum proteins using human serum samples from normal controls (n = 25) and patients with liver cirrhosis (n = 25) or hepatocellular carcinoma (HCC; n = 29). Median-centered normalization improved correlation coefficients, while IgM-based normalizations improved coefficients of variation. The TIS assay was more efficient, economical, and reproducible for determining IgM concentrations than enzyme-linked immunosorbent assay. Additionally, we normalized antibody array data for six serum proteins using the median-centered/IgM-TIS assay, and evaluated serum biomarkers through distribution analysis of normalized fluorescence intensities and receiver operating characteristic analyses for the diagnosis of liver cirrhosis and HCC. Apolipoprotein A-1 and a combination of alpha-fetoprotein and C-reactive protein were determined to be potential serological biomarkers for liver cirrhosis and HCC, respectively. Thus, median-centered/IgM-TIS assay normalization is a useful approach for analyzing antibody array data and evaluating serological biomarkers for the diagnosis of liver disease or cancers. Second, we have developed an assay using peptide arrays based on phase transition from the glass substrate to the liquid for monitoring quantitative protease activity in real-time. Peptide arrays were fabricated using a bifunctional cross-linker, N-[γ-maleimidobutyryloxy] sulfosuccinimide ester, and a substrate peptide containing two functional groups, cysteine and tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA) on the C- and N-terminus, respectively. The phase transition-based peptide arrays were characterized by analyzing the substrate peptide cleaved from the solid substrate by matrix metalloproteinase-3 (MMP-3). We successfully used this assay to determine quantitative proteolytic activity of MMP-3 in a dose-dependent manner. In addition, parameters including Michaelis constant (Km), maximum rate of enzymatic reaction (Vmax), and half maximal inhibitory concentration (IC50) were determined by analyzing the concentrations of substrate peptide cleaved by MMP-3. Therefore, this new assay has potential for the quantitative analysis of enzyme kinetics of protease and informs research developments in drug discovery utilizing kinetic studies. Third, we present a novel peptide array based on fluorescence phosphorylation sensor for analysis of c-AMP dependent protein kinase (PKA) activity. In the present study, we used kemptide (the protein kinase A [PKA] substrate peptide) and PKA catalytic subunit C? (cPKA) arrays to evaluate serological PKA (sPKA) activity and autoantibody levels, respectively. The sensitivity of the on-chip sPKA activity assay was enhanced by Triton X-100, with a 0.01 U/mL detection limit. Protein kinase peptide inhibitor (PKI) decreased PKA activity in a dose-dependent manner, with a maximal effect at 0.5 ?M. We analyzed sPKA activities and autoantibody levels in sera from normal individuals (n = 30) and patients with hepatic (n = 30), gastric (n = 30), lung (n = 30), or colorectal (n = 30) cancers. sPKA activities in human sera from cancer patients were much higher than those in controls. The sPKA activity assay for cancer patients (n = 120) showed 90.0% sensitivity and 90.0% specificity at the cutoff value of 3.5 U/mL, with an area under the curve value of 0.966. However, no significant differences in PKA autoantibody levels were found between groups. Additionally, sPKA activities were not correlated with sPKA autoantibody levels. These results suggest that sPKA activity rather than autoantibody level could be used as a biomarker for cancer diagnosis. Furthermore, on-chip sPKA activity assay could be useful for cancer diagnosis and investigating PKA-related human diseases.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION -------------------------------------------------------------------1
• 1. Normalization using a tagged-internal standard assay for analysis of antibody arrays and the evaluation of serological biomarkers for liver disease --------1
• 2. Monitoring of proteolytic enzyme activity using phase transition-based peptide arrays -------------------------------------------------------------------------4
• 3. Highly sensitive ECPKA activity assay using fluorescence-based peptide arrays for evaluation as cancer biomarker ----------------------------------------7
• II. REVIEW OF LITERATURE ----------------------------------------------------12
• 1. Microarray ----------------------------------------------------------------------------12
• 2. Surface modification ----------------------------------------------------------------13
• 3. Detection methods -------------------------------------------------------------------14
• 3-1. Labeling detection methods --------------------------------------------------15
• 3-2. Label-free detection methods ------------------------------------------------16
• 4. Applications --------------------------------------------------------------------------18
• III. MATERIALS AND METODES -----------------------------------------------20
• IV. RESULTS ---------------------------------------------------------------------------34
• 1. Normalization using a tagged-internal standard assay for analysis of antibody arrays and the evaluation of serological biomarkers for liver disease ---------------------------------------------------------------------------------34
• 1-1. Analysis of serum proteins using antibody arrays ------------------------34
• 1-2. Determination of normalization factors by TIS assays and ELISAs based on serum IgM levels -----------------------------------------------------------34
• 1-3. Evaluation of the normalization methods ----------------------------------36
• 1-4. Distribution of proteins in human sera --------------------------------------37
• 1-5. Validation of antibody array data by Western blot ------------------------39
• 2. Monitoring of proteolytic enzyme activity using phase transition-based peptide arrays -----------------------------------------------------------------------40
• 2-1. Characterization of phase transition-based peptide arrays for monitoring of enzyme activity -------------------------------------------------------------40
• 2-2. Monitoring of MMP-3 activity ----------------------------------------------41
• 2-3. Kinetic study of MMP-3 using phase transition-based peptide arrays
• ------------------------------------------------------------------------------------42
• 3. Highly sensitive ECPKA activity assay using fluorescence-based peptide arrays for evaluation as cancer biomarker ------------------------------------43
• 3-1. Optimization of on-chip sPKA activity assays using fluorescence-based peptide arrays ------------------------------------------------------------------43
• 3-2. Sensitivity enhancement of on-chip PKA activity assay by Triton X-100 and characterization of the PKA activity assay ----------------------------44
• 3-3. Determination of sPKA activity in human sera ----------------------------45
• 3-4. Serological PKA autoantibody assay optimization using cPKA protein arrays ----------------------------------------------------------------------------47
• 3-5. Analysis of sPKA autoantibody levels in human serum samples and its correlation with sPKA activity -----------------------------------------------48
• V. DISCUSSION -----------------------------------------------------------------------50
• VI. REFERENCES --------------------------------------------------------------------61
• VII. ABSTRACT (IN KOREAN) -------------------------------------------------106