개 Peroxiredoxin II의 변형 동정 및 특성 연구 = Indentification and Characterization of Modified Canine Peroxiredoxin 2

국문 초록 (Abstract)

항산화 효소로 잘 알려져 있는 Prx는 포유동물의 경우 6종의 isotype이 존재한다. 각각의 Prx는 시스테인의 갯수에 따라 세 가지 그룹(Typical 2-Cys, Atypical 2-Cys, Typical 1-Cys)으로 나누어 진다. Typical 2-Cys Prx로 포함된 Prx I-IV는 두 개의 잘 보존된 시스테인 잔기를 가지고 있다. 두 개의 잘 보존된 시스테인 중 N-말단 쪽에 위치한 peroxidatic 시스테인은, 과산화 화합물과 직접 반응하는 촉매활성에 필수적인 시스테인이다. 그리고 C-말단 쪽에 위치한 resolving 시스테인의 역할은, peroxidatic 시스테인이 기질인 과산화 화합물을 환원하면서 -SOH(sulfenic acid)로 산화되면, 이때 상보적 가닥에 위치한 resolving 시스테인과 이황화 결합(disulfide bond)을 형성한다. 이렇게 형성된 이황화 결합은 thioredoxin의 환원력을 이용하여 다시 -2SH로 환원되어 다른 과산화 화합물을 환원할 수 있는 상태로 된다. 이렇게 Prx는 항산화 효소로서 기능을 한다. 또한 기질인 H2O2의 농도가 높아져 Prx가 과산화(hyperoxidation)되어지거나, 열변성에 의한 단백질의 침전이 일어나게 되면, Prx는 과산화효소 활성은 낮아지고 샤페론(chaperone) 활성이 나타난다. 이처럼 Prx는 과산화효소의 역할과 샤페론효소의 역할을 수행하는 두 가지 기능을 가진다.
또한 세포내 2차 신호전달물질로 작용하는 아주 낮은 농도의 H2O2 농도를 조절하여 세포내 신호 전달 및 세포 증식에 관여하기도 하며 한다.
본 연구는 2차원 젤 전기영동을 이용하여 Prx 카르복시 말단 절단화의 탐색을 수행하던 중, MDCK (Madin-Darby Canine Kidney)세포내 Prx II의 경우 사람이나 쥐 등, 다른 포유동물들의 Prx II와는 다르게 양극으로 이동한 spot(acidic migrated spot)의 양이 많음을 확인하게 되었다. 2차원 겔 전기이동상 패턴이 다른 이유는 단백질의 변형 때문일 것으로 가정하여 각각의 spot들이 과산화(hyperoxidation)되었는지를 확인하였다. 과산화수소(H2O2)를 처리한 후, regeneration하여 각각 spot들의 이동을 살펴보았다. 모든 spot들이 산화되어 양극으로 이동하였고, regeneration에 의해 원래 위치로 돌아왔다. 이로써 각각의 spot들은 과산화가 아닌 다른 modification에 의해 양극으로 이동했음 알 수 있었다. 2D 겔 전기이동으로 분리되는 Canine Prx II 4개의 spot중 가장 음극 쪽에 위치한 spot과 한 칸 양극으로 이동한 spot의 차이는, 각각의 2-21번 펩타이드 peak에서 mass값 42 차이를 확인할 수 있었고, 이 펩타이드내에 단백질 아세틸화가 일어났음을 MALDI-TOF MS를 통하여 확인하였다. Canine Prx II 2-21번 펩타이드내에는 두 개의 lysine을 포함하고 있다. 이는 단백질 아세틸화가 첫 번째 methionine이 떨어져 나간 후 두 번째 잔기에 일어나는 Na-acetylation인지, lysine ε-아민 그룹에 일어나는 N-acetylation인지 확인하기 위하여, lysine ε-아민 그룹의 아세틸화를 확인할 수 있는 항체로 탐색하여 본 결과, 개와 사람의 Prx II에서는 lysine의 아세틸화는 확인되지 않았고, 음극으로 한 칸 이동한 개와 사람의 Prx I에 아세틸화가 일어났음을 알 수 있었다. 그리고 개와 사람 Prx II의 두 번째 아미노산을 각각을(개 Prx II, Threonine→Alanine; 사람 Prx II, Alanine→Threonine) 변형하여 사람 폐암 A549세포에 과발현 후, 2차원 겔 전기영동상 양상을 비교해 본 결과 개의 Prx II 양극 쪽에 위치한 spot은 사라졌고, 사람의 Prx II 양극 쪽에 새로운 spot이 생겨남을 알 수 있었다. 이 결과 Prx II의 경우 N-말단에서 두 번째 아미노산이 threonine인 경우 일부 Nα-아세틸화가 일어나지 않으며, 두 번째 아미노산이 alanine일 경우 모두 Nα-아세틸화됨을 확인하였다.

목차 (Table of Contents)

• I. 서론 1
• II. 재료 및 방법 5
• 1. 재료 및 세포 배양 5
• 2. 유전자 클로닝 5
• 3. 이차원 젤 전기이동 6
• 4. Western immunoblot 7
• 5. Stripping 7
• 6. 젤 염색 8
• 7. 젤 내 단백질 분해 8
• 8. MALDI-TOF 질량 분석기에 의한 분석 9
• 9. H2O2 처리 9
• Ⅲ. 결과 10
• 1. 사람과 개의 Prx I과 Prx II의 이차원 젤 전기이동 양상 비교 10
• 2. MDCK 세포의 Prx II의 hyperoxidation과 regeneration 10
• 3. MDCK 세포에 아데노바이러스를 이용한 사람 Prx II의 과발현 11
• 4. A549 사람 폐암 세포에 사람 Prx II 및 개 Prx II의 과발현 11
• 5. MDCK 세포에 내재하는 Prx II와 E.coli에서 발현된 개 Prx II의 이차원 전기이동 양상 비교 15
• 6. 개의 적혈구에서 분리한 Prx II의 a 스팟과 b 스팟의 peptide fingerprinting 15
• 7. MDCK 세포에 내재하는 Prx I의 N-아세틸화 확인 18
• 8. A549 사람 페암 세포에 사람과 개 Prx II 및 mutant들의 과발현 21
• Ⅳ. 고찰 24
• Ⅴ. 참고 문헌 28
• 영문 초록 31