한우의 Trichophyton verrucosum 감염에 대한 유산균 발효 대사산물과 황토배합 복합물의 치료 효과 = Antifungal effect of lactobacillus-fermented fruits and vegetables products and their mixture with red clay against Trichophyton verrucosum infection in Hanwoo

국문 초록 (Abstract)

연구배경: 한우의 버짐은 Trichophyton verrucosum을 원인균으로 하는 인수공통 질환으로 최근 20년간 치료법에 대한 연구 보고가 없는 상태이다.
소버짐의 문제점으로는 높은 우사내 감염율, 비육 저하로 인한 농가 소득의 감소, 유황, 폐유 등 기존 치료제의 낮은 완치율, 항진균주사제와 피부도포제 사용에 대한 고비용, 체내축적 약물의 안전성 기준 결여 등을 들 수 있다. 또한 사람에게 전염될 경우에는 잠행백선의 진행으로 진단과 치료가 어렵고 그 증상이 심각하다고 보고된다. 따라서 치료 효과가 높고 보다 친환경적이며 안전하고 비용 효과적인 치료제에 대한 연구개발이 필요하다.

실험군: 최근 유산균에 대한 다양한 의학적 효과가 과학적으로 입증되고 있으며 이에 17종 식약용식물에 유산균을 접종 발효하여 생성된 대사산물(이하 FM)과 황토를 배합한 복합물질(이하 FM with Red Clay)을 만들어 Trichophyton verrucosum균에 대한 항진균 효과를 측정하였다.

결 과: 1. 사람의 아토피의 SCORAD 지수와 건선의 PASI 지수를 근거로 하여 소버짐 부위별 분포 병변의 각질 모양과 특성을 반영한 중증도 지표를 만들었다.
2. FM with red clay의 소버짐의 100% 치료율로 탈모 부위의 발모가 시작되는데 소요되는 기간은 8.42±4.00일, 50% 병변 소실에 소요되는 기간은 18.57±9.71일, 100% 병변 소실에 소요되는 기간은 29.04±14.01일이었다. 100% 완치에 소요되는 기간에 영향을 주는 요인들 중에서는 축사 바닥환경(p<0.05), 각질의 형태와 가피 두께, 병변 총면적(p<0.01)이 유의한 차이를 보였다.

3. FM with Red Clay 복합물에 대한 실험실 분석 결과는 다음과 같다.
- DPPH 라디칼 소거 활성 능력은 44.7±0.73%, Trolox Equivlence는 66.34±1.795%였다.
- NGS 분석 결과 Firmicutes 36.78% Actinobacteria 24% Proteobacteria 27.59%의 분포도를 보이고 총 26문(Phylum),74강(Class), 149목(Order), 308과(Family), 825속(Genus), 1826종(Species) 의 Microbiome이 형성되어 있었다.

4. FM의 API kit 효소활성 분석 결과, 베타글루코시다제를 포함한 11종의 효소가 검출되었다.


5. 배양된 Trichophyton verrucosum을 접종한 배지 감수성 결과 3주간의 관찰기간 동안 FM과 FM with Red Clay 복합물을 추가한 배지 모두에서 Trichophyton verrucosum 균주의 성장이 억제되었다. 반면에 FM with Red Clay 배지에서는 황토에서 유래되었으며 Trichophyton verrucosum의 성장 억제에 기여했을 것으로 추정되는 Brettanomyces bruxellensis, Purpureocillium lilacinum, Talaromyces trachyspermus의 3가지 균주 군집이 관찰되었다.


결 론: 기존 치료 방법은 통상적으로 4주~9주의 치료 기간이 소요되는 것으로 보고되어졌고 심한 경우 9달이 소요된다고 보고된 것도 있으므로 FM with Red Clay는 Trichophyton verrucosum 감염에 대한 본 연구적용의 경우는 짧게는 1회 치료 1주후 완쾌의 결과를 보인 친환경적인 방법일 뿐만 아니라 치료 기간도 짧은 효율적 치료로 평가할 수 있다. 이는 유산균 발효산물에 포함된 폴리페놀류의 대사물과 유산균이 생성한 활성효소, 황토에서 유래된 곰팡이류에서 생성된 활성효소가 갖고 있는 항염, 항균, 항진균 작용이 복합적으로 기여했을 것으로 사료된다.

항진균 효과가 확인된 유산균 대사산물과 황토배합 천연조성물은 소버짐균에 국한하지 않으며 사상균 감염 전체에 적용 가능한 친환경 물질이다. 개, 고양이 기타 반려동물의 피부질환과 건강 및 인수공통 감염을 차단함으로 인해 사람의 건강을 지키기에 적합한 것으로 사료된다. 향후 본 연구의 결과를 바탕으로 가축의 항진균 감염에 예방, 치료 및 경제적인 측면에서 모두 효과적인 특정 활성 대사산물의 탐색 및 발굴, 농도, 투여방법 결정 등을 위해 보다 세부적인 연구가 필요하리라 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: Trichophytia in Hanwoo (Korean native cattle) is a zoonotic disease by Trichophyton verrucosum, whose therapy has not been reported in recent 20 years.
Various problems caused by the disease include high infection rate in cowsheds, reduction of income of farm households owing to decreased number of beef cattle, low healing rate of previous therapeutic drugs such as sulfur and waste oil, high cost due to use of antifungal parenteral agents or dermal topical drugs, and deficiency of safety standard for the drugs accumulating in the body.
In case of its infection to human, it is reported that the progression of latent ring worm makes the diagnosis and treatment difficult and even causes serious symptoms. Therefore studies to develop a therapeutic drug that is more eco-friendly, safer, more cost-effective, and with higher efficiency of treatment, are requested.

Experimental groups: Recently, various medical effects about the lactobacillus have been scientifically validated. Therefore, the antifungal effects of two types of lactobacillus-derived materials - a fermented product by inoculating lactobacilli to 17 food-medicinal plants (designated as FM) and the products mixed with red clay (designated as FM with Red Clay) - against Trichophyton verrucosum, were measured.

Results: 1. Severity index for the skin diseases of Hanwoo was newly made based on SCORAD index for atopy and PASI index for psoriasis in human, which reflects the shapes and characteristics of the keratins in the lesions of the cattle. 2. For therapeutic rate in FM with Red Clay group, the onset period for reappearing of hairs in the hair loss regions was 8.42±4.00days, the period for 50% disappearance of hair loss area was 18.57±9.71days, and the period for 100% disappearance of hair loss area was 29.04±14.01days. Among factors affecting the period for 100% cure, there were significant differences in the ground environment of the cattle shed (p<0.05), the shape of the keratins and the thickness of crusts, total area of the lesions (p<0.01). 3. For laboratory findings for the FM with Red Clay group are as follows.
- DPPH radical scavenging activity 44.7±0.73%, and Trolox Equivlence 66.34±1.795%.
- Analysis of NGS shows distribution rates of Firmicutes 36.78%, Actinobacteria 24%, and Proteobacteria 27.59% revealing formed microbiomes of 26 Phyla, 74 Classes, 149 Orders, 308 Families, 825 Genera, 1826 Species.
4. Analysis of enzyme activities of FM group using API kit detected 11 enzymes including β-glucosidase.
5. Susceptibility test using Trichophyton verrucosum-inoculated media for 3 weeks showed the inhibited growth of Trichophyton verrucosum bacteria in both of the FM and FM with Red Clay-added media. Moreover, in FM with Red Clay-added media, 3 bacterial colonies - Brettanomyces bruxellensis, Purpureocillium lilacinum, and Talaromyces trachyspermus were observed, which were thought to be derived from the red clay and supposed to contribute to the inhibited growth of Trichophyton verrucosum.

Conclusion: FM with Red Clay can be evaluated as both eco-friendly and effective therapy against Trichophyton verrucosum infection as to show 1 week cure at 1 time trial with short treatment period. It is thought that the effect may be contributed from the anti-inflammatory, antibacterial, and antifungal activities kept by polyphenol substances included in the lactobacillus-fermented products and by free radicals produced from the lactobacilli and fungi derived from the clay.
The lactobacillus products and clay-mixed natural substances are applicable not only to trichophytia in cattle, but also to all mycoses. It is thought to be adequate to protect human health by blocking the skin diseases of companion animals like dogs and cats, and by interfering zoonotic infections. Further detailed studies are requested to find more efficient and specific active metabolic products against fungal infections of animals in terms of prevention and treatment as well as an economic point of view, on the basis of the results of this study.

Key Words: Ring worm (trichophytia) in cattle, Hanwoo,
Antifungal, Trichophyton verrucosum, Zoonosis, Eco-friendly,
Lactobacillus-fermented products, Red clay mixture, Microbiome, Fermentation products

목차 (Table of Contents)

• I. 서론
• 1. 연구 배경 1
• 2. 연구 목적 5
• II. 이론적 배경
• 1. Trichophyton verrucosum 감염 (소 버짐) 6
• 가. 소 버짐병의 역학조사 연구 6
• 나. 소 버짐병의 치료 8
• 다. 동물로부터 전염된 사람의 피부사상균 감염 10
• 2. 유산균과 발효 산물의 항진균 효과 15
• 3. 황토의 항진균 효과 17
• III. 연구방법
• 1. 연구설계 20
• 2. 실험대상 21
• 가. 실험대상 선정기준 21
• 나. 제외기준 21
• 3. 실험도구의 제조 및 항진균 효과 검증 22
• 가. 유산균 발효 산물과 황토 배합물 제작 22
• 나. FM의 항산화 기능 검증 23
• 다. 생식세포를 이용한 안정성 검증 23
• 라. FM의 API kit를 이용한 효소 생산능 분석 23
• 마. Next Generation Sequence분석을 통한 염기서열 확인 24
• 바. 소 버짐 병변 검체채취 24
• 사. Trichophyton verrucosum 균주의 현미경 하 관찰 및 배양 24
• 아. 평판배지 디스크 확산법에 의한 FM, FM with Red Clay의 항진균 효과 측정 24
• 4. 소 버짐 치료 연구방법 25
• 5. 자료 분석방법 (통계) 26
• 가. 버짐 치료 기간에 미치는 환경 효과 26
• 나. 발모 시기, 50% 치료시기 및 전체 치료기간의 변화 추세의 추정 27
• IV. 연구 결과 및 고찰
• 1. DPPH 라디컬 소거 활성실험 결과 29
• 2. 생식세포를 이용한 안정성 검증 결과 32
• 3. 체정된 정자의 FM 처리 후 Fax와 형광 염색을 검사 34
• 4. 채집 정액에 FM 처리를 한 동결 정액을 이용한 인공수정 결과 41
• 5. NGS 기법을 이용한 16sRNA 염기서열 분석 결과 42
• 6. FM의 API kit를 이용한 효소 생산능 분석 46
• 7. 소 버짐 검체의 KOH 검사법을 이용한 균주 확인 49
• 8. FM FM with Red Clay의 Trichophyton verrucosum균 감수성 검사 결과 51
• 9. 소 버짐 치료 전후 개체의 육안적 관찰 변화 사진 57
• 10. FM with Red Clay의 소 버짐 치료 효과 분석 63
• V. 결론 및 제언
• 참고문헌 103
• 영문요약 120

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72 박민우, "최근 10년간 잠행백선에 대한 임상 및 원인균주 분석: 단일기관 경험 A Clinical and Etiological Analysis of Tinea Incognito Over 10 Years: A Single-Center Experience 대한의진균학회지 (4) pp", 159~166, 2017

73 장예은, "Consumption of dairy yogurt containing Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, Bifidobacterium animalis ssp. lactis and heat-treated Lactobacillus plantarum improves immune function including natural killer cell activity", 연세대 학위논문, 2017

74 장유신, "편백나무 건조 중 발생하는 휘발성 유기화합물의 항진균 및 항산 화 활성 Expression of Secretion-dedicated Srb Homologue and Antifungal Activitiy ofBacillus lentimorbus WJ5 한국미생물학회 (3) pp", 135~140, 2003

75 정택경, "세신 정유 추출물의 피부진균 및 기회감염진균에 대한 항진균 효 과 Antifungal Activity and Plant Growth Promotion by Rhizobacteria Inhibiting Growth of Plant Pathogenic Fungi 한국미생물학회 (1) pp", 16~21, 2012

76 서영준, "전나무 정유의 항진균 효과와 유효성분의 시너지효과 평가 Antifungal and Antioxidant Activities of Volatile Organic Compounds Generated During the Drying Process of Chamaecyparis obtuse 한 국미생물학회 (4) pp", 305~308, 2012

77 이창호, "김치로부터 항돌연변이 물질을 생산하는 유산균의 분리 및 특성 Isolation and Characterization of Lactic Acid Bacteria Producing Antimutagenic Substance from Korean Kimchi 한국미생물 생명공학 회지 년 27권", 1호 pp 15-22, 1999

78 양은주, "메주에서 분리한 Bacillus polyfermenticus CJ6가 생산하는 항진 균 물질의 분리 및 특성 Isolation and Characterization of Antifungal Compounds Produced by Bacillus polyfermenticus CJ6 Isolated from Meju Korean J. Microbiol", Biotechnol. Vol. 40, No. 1, 57–65, 2012

79 김선홍, "다양한 유/무기계 항진균제를 이용한 항균모르타르의 항곰팡이 성 능 평가 Evaluation on Anti-fungal Activity and Synergy Effects of Essential Oil and Their Constituents from Abies holophylla 한국목재 공학회 (1):pp", 113~123, 2016

80 한귀환, "황토로부터 분리한 Bacillus licheniformis의 항진균 chitinase 생 산과 효소 특성 Production and Characterization of Antifungal Chitinase of Bacillus licheniformis Isolated from Yellow Loess 한국 생물공학회 년 29권 3호 pp", 131-138, 2014

81 강교신, "A Case of Tinea Corporis Caused by Trichophyton verrucosum Showing Tinea Imbricata-like Clinical Appearance A Case of Tinea Corporis Caused by Trichophyton verrucosum Showing Tinea Imbricata-like Clinical Appearance 대한의진균학회지 (4) pp", 181~186, 2008

82 김혜영, "메주에서 분리한 Bacillus polyfermenticus CJ6가 생산하는 항진 균물질의 분리 및 특성 Isolation of Antifungal Substances by Bacillus amyloliquefaciens IUB158-03 and Antagonistic Activity against Pathogenic Fungi 한국균학회 (1) pp", 96~103, 2009