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      Cloning and sequencing of the virulence regulatory genes of vibrio vulnificus = Vibrio vulnificus 병원성 인자들의 발현을 조절하는 조절유전자의 클로닝과 염기서열분석에 관한 연구

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      https://www.riss.kr/link?id=T2679339

      • 저자
      • 발행사항

        광주 : 전남대학교 대학원, 1997

      • 학위논문사항

        학위논문(박사) -- 전남대학교 대학원 , 의학과 , 1997. 8

      • 발행연도

        1997

      • 작성언어

        영어

      • 주제어
      • KDC

        511.5 판사항(4)

      • DDC

        616.944 판사항(20)

      • 발행국(도시)

        광주

      • 형태사항

        ii, iv, 103p. : 삽도 ; 26cm

      • 일반주기명

        지도교수: 정희식
        참고문헌: p. 91-100

      • 소장기관
        • 광주대학교 도서관 소장기관정보
        • 국립순천대학교 도서관 소장기관정보
        • 국립중앙도서관 국립중앙도서관 우편복사 서비스
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      국문 초록 (Abstract)

      V. cholerae와 V. parahaemolyticus에서 toxRS 유전자는 다양한 환경으로부터 신호를 받아들이고 병원성 인자들의 발현을 조절하는 조절 유전자로써 밝혀져 있다. 그러나 치명적인 패혈증을 일으키는 V. vulnificus 병원성 인자들의 발현을 조절하는 조절유전자에 대해서는 알려진 바 없다. 이에 본 저자는 V. vulnificus에서 병원성 인자들의 발현을 조절하는 조절유전자를 밝히기 위하여 먼저 V. cholerae와 V. parahaemolyticus의 toxRS 유전자의 염기서열을 비교 분석하여 한 쌍의degenerate primer 만들어 이들 유전자와 상동성을 보이는 V. vulnificus의 핵산절편을 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭하였다. 약 900 개의 염기를 가진 핵산절편이 증폭되었으며 이 절편을 클로닝하고 염기서열을 분석하였고 20개의 제한효소로 절단하였다. 클로닝된 핵산 절편의 염기서열은 V. cholerae와 V. parahaemolyticus의 toxRS 유전자의 염기서열과 약 60%의 상동성을 보였으며, 특징적으로 제한효소 HindIII에 의해 약 300개와 600개의 염기를 가진 두개의 작은 절편으로 절단되었다. 그래서 본 저자는 이 클로닝된 핵산 절편들을 V. vulnificus의 완전한 toxRS 유전자를 클로닝하기 위한 포식자로써 사용하였다. V. vulnificus ATCC 29307의 염색체를 분리하고 이를 여러 가지 제한효소로 절단한 다음 Southern blot 분석법에 의해 포식자와 반응하는 염색체 절편들을 검사하였다. 약 4.0kb의 크기를 가진 BglII 절편, 약 2.0kb의 크기를 가진 EcoRV 절편, 약 3.0kb의 크기를 가진 SstI 절편과 약 1.2kb와 6.1kb의 크기를 가진 HindIII 절편들이 양성반응을 보였다. 이들 양성반응을 보인 절편들 중에서 여러 가지 유전자 조작에 적절한 크기를 가진 BglII 절편을 완전한 toxRS 유전자를 클로닝하는데 사용하였다. BglII 절편을 다시 제한효소 HindIII로 절단하여 HindIII 절편과 HindIII-BglII 절편 각각을 클로닝하고 염기서열을 분석하였다. 2,694개의 염기를 가진 두 개의 절편은 완전한 toxRS 유전자를 포함하고 있었으며 V. cholerae와 V. parahaemolyticus의 toxRS 유전자와 약 60%의 상동성을 보였다. V. vulnificus ATCC 29307 외 같은 종의 다른 균주들과 같은 Vibrio 속의 다른 종들에서도 클로닝된 toxRS 유전자가 존재하는지를 알아보기 위해 DNA-colony blot 분석법을 시행하였다. 모든 V. vulnificus 균주들은 높은 stringency(68℃)에서도 강한 양성반응들 보였으나 다른 Vibrio 종들에서는 높은 stringency 에서는 양성반응을 보이지 않았으며 낮은 stringency(60℃와 55℃)에서 약한 양성반응을 보인 경우도 있었다. 이 결과는 핵산 염기서열 분석결과를 뒷받침하며 모든 V. vulnificus 균주들은 클로닝된 toxRS 유전자와 같은 유전자를 가지고 있으며 몇몇 다른 Vibrio 종들에서도 클로닝된 toxRS 유전자와 약간의 상동성을 지닌 유전자를 가지고 있는 것으로 판단되었다. ToxRS 단백의 발현과 장차의 계속적인 연구를 위하여 toxRS 유전자의 open reading frame 만을 포함한 절편을 중합 효소연쇄반응으로 증폭하여 클로닝하였으며 기타 몇 가지 subclone을 구축하였다.
      결론적으로 본 연구를 통해 V. cholerae와 V. parahaemolyticus의 toxRS 유전자와 상동성을 보이는 V. vulnificus의 toxRS 유전자를 동정하고 클로닝하여 염기서열을 밝힐 수 있었다. 앞으로 계속적인 연구를 통하여 환경으로부터 신호를 받아들이고 병원성 인자들의 발현에 미치는 V. vulnificus의 toxRS 유전자의 역할은 밝혀지리라 생각한다.
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      V. cholerae와 V. parahaemolyticus에서 toxRS 유전자는 다양한 환경으로부터 신호를 받아들이고 병원성 인자들의 발현을 조절하는 조절 유전자로써 밝혀져 있다. 그러나 치명적인 패혈증을 일으키는 ...

      V. cholerae와 V. parahaemolyticus에서 toxRS 유전자는 다양한 환경으로부터 신호를 받아들이고 병원성 인자들의 발현을 조절하는 조절 유전자로써 밝혀져 있다. 그러나 치명적인 패혈증을 일으키는 V. vulnificus 병원성 인자들의 발현을 조절하는 조절유전자에 대해서는 알려진 바 없다. 이에 본 저자는 V. vulnificus에서 병원성 인자들의 발현을 조절하는 조절유전자를 밝히기 위하여 먼저 V. cholerae와 V. parahaemolyticus의 toxRS 유전자의 염기서열을 비교 분석하여 한 쌍의degenerate primer 만들어 이들 유전자와 상동성을 보이는 V. vulnificus의 핵산절편을 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭하였다. 약 900 개의 염기를 가진 핵산절편이 증폭되었으며 이 절편을 클로닝하고 염기서열을 분석하였고 20개의 제한효소로 절단하였다. 클로닝된 핵산 절편의 염기서열은 V. cholerae와 V. parahaemolyticus의 toxRS 유전자의 염기서열과 약 60%의 상동성을 보였으며, 특징적으로 제한효소 HindIII에 의해 약 300개와 600개의 염기를 가진 두개의 작은 절편으로 절단되었다. 그래서 본 저자는 이 클로닝된 핵산 절편들을 V. vulnificus의 완전한 toxRS 유전자를 클로닝하기 위한 포식자로써 사용하였다. V. vulnificus ATCC 29307의 염색체를 분리하고 이를 여러 가지 제한효소로 절단한 다음 Southern blot 분석법에 의해 포식자와 반응하는 염색체 절편들을 검사하였다. 약 4.0kb의 크기를 가진 BglII 절편, 약 2.0kb의 크기를 가진 EcoRV 절편, 약 3.0kb의 크기를 가진 SstI 절편과 약 1.2kb와 6.1kb의 크기를 가진 HindIII 절편들이 양성반응을 보였다. 이들 양성반응을 보인 절편들 중에서 여러 가지 유전자 조작에 적절한 크기를 가진 BglII 절편을 완전한 toxRS 유전자를 클로닝하는데 사용하였다. BglII 절편을 다시 제한효소 HindIII로 절단하여 HindIII 절편과 HindIII-BglII 절편 각각을 클로닝하고 염기서열을 분석하였다. 2,694개의 염기를 가진 두 개의 절편은 완전한 toxRS 유전자를 포함하고 있었으며 V. cholerae와 V. parahaemolyticus의 toxRS 유전자와 약 60%의 상동성을 보였다. V. vulnificus ATCC 29307 외 같은 종의 다른 균주들과 같은 Vibrio 속의 다른 종들에서도 클로닝된 toxRS 유전자가 존재하는지를 알아보기 위해 DNA-colony blot 분석법을 시행하였다. 모든 V. vulnificus 균주들은 높은 stringency(68℃)에서도 강한 양성반응들 보였으나 다른 Vibrio 종들에서는 높은 stringency 에서는 양성반응을 보이지 않았으며 낮은 stringency(60℃와 55℃)에서 약한 양성반응을 보인 경우도 있었다. 이 결과는 핵산 염기서열 분석결과를 뒷받침하며 모든 V. vulnificus 균주들은 클로닝된 toxRS 유전자와 같은 유전자를 가지고 있으며 몇몇 다른 Vibrio 종들에서도 클로닝된 toxRS 유전자와 약간의 상동성을 지닌 유전자를 가지고 있는 것으로 판단되었다. ToxRS 단백의 발현과 장차의 계속적인 연구를 위하여 toxRS 유전자의 open reading frame 만을 포함한 절편을 중합 효소연쇄반응으로 증폭하여 클로닝하였으며 기타 몇 가지 subclone을 구축하였다.
      결론적으로 본 연구를 통해 V. cholerae와 V. parahaemolyticus의 toxRS 유전자와 상동성을 보이는 V. vulnificus의 toxRS 유전자를 동정하고 클로닝하여 염기서열을 밝힐 수 있었다. 앞으로 계속적인 연구를 통하여 환경으로부터 신호를 받아들이고 병원성 인자들의 발현에 미치는 V. vulnificus의 toxRS 유전자의 역할은 밝혀지리라 생각한다.

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      다국어 초록 (Multilingual Abstract)

      A number of pathogenic bacteria have been reported to have genes for transducing signals from the environment and regulating the expression of virulence genes. The toxRS regulons of V. cholerae (Vc-toxRS) and V. parahaemolyticus (Vp-toxRS) are the two well-known ones. Reports concerning the virulence regulating genes of V. vulnificus, which causes fatal septicemia in susceptible patients of underlying hepatic diseases and immunocompromised conditions, are not available yet. As an effort to dissect the virulence regulatory system of V. vulnificus, the homolog of Vc-toxRS and Vp-toxRS was cloned and sequenced. By comparing the sequences of the two previously reported toxRS genes, a set of degenerate primers targeting to relatively conserved regions was designed. A DNA fragment of 864 bp was amplified from the chromosome of V. vulnificus by PCR, and cloned into a cloning vector. The DNA sequence of the insert showed about 60% homology with the Vc-toxRS and Vp-toxRS. With enzymatic restriction and sequence analysis, a HindIII site was found. The DNA fragment was used as an authentic probe for the cloning of toxRS homolog in V. vulnificus (Vv-toxRS). The chromosomal DNA extracted from V. vulnificus ATCC 29307 was digested with various restriction enzymes and analyzed by Southern blotting. The BglII fragments of 4.0 kb and the HindIII fragments of 1.2 and 6.1 kb showing positive signals were used for the chromosomal Vv-toxRS cloning. An 1.6 kb BglII-HindIII fragment and an 1.2 kb HindIII fragment was finally cloned and sequenced. The two fragments with 2,696 bp included 2 open reading frames (ORFs), Vv-toxR and Vv-toxS, showing significant homologies to Vc-toxRS and Vp-toxRS. The intact chromosomal Vv-toxRS fragment was identified and cloned by PCR amplification. The fragments including only the ORF of toxR or toxS was also amplified with PCR and constructed into subclones for the further study. The Vv-toxR DNA sequence shared homologies of 54.7% and 62.0% with the Vc-toxR and Vp-toxR, respectively. At the amino acid level, Vv-ToxR was 55.0% and 63.0% homologous to the Vc-ToxR and Vp-ToxR, respectively. The Vv-toxR showed 64.9% and 66.0% DNA, and 65.7% and 71.5% amino acid sequence homologies with Vc-toxS and Vp-toxS respectively. The Vv-toxRS homologs in other Vibrios were screened by using the cloned Vv-toxRS DNA fragment as a probe through the DNA-colony blot hybridization. All strains of V. vulnificus showed positive signals at high stringency and some other Vibrio species showed weak positive signals at low stringencies but no positivity at high stringency. These results indicate that all V. vulnificus strains have toxRS, and the Vv-toxRS homologs might be generally distributed in other Vibrio species including V. cholerae and V. parahaemolyticus. In conclusion, the Vv-toxRS were successfully identified, cloned, and sequenced and it will be used for studying virulence regulatory mechanisms.
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      A number of pathogenic bacteria have been reported to have genes for transducing signals from the environment and regulating the expression of virulence genes. The toxRS regulons of V. cholerae (Vc-toxRS) and V. parahaemolyticus (Vp-toxRS) are the two...

      A number of pathogenic bacteria have been reported to have genes for transducing signals from the environment and regulating the expression of virulence genes. The toxRS regulons of V. cholerae (Vc-toxRS) and V. parahaemolyticus (Vp-toxRS) are the two well-known ones. Reports concerning the virulence regulating genes of V. vulnificus, which causes fatal septicemia in susceptible patients of underlying hepatic diseases and immunocompromised conditions, are not available yet. As an effort to dissect the virulence regulatory system of V. vulnificus, the homolog of Vc-toxRS and Vp-toxRS was cloned and sequenced. By comparing the sequences of the two previously reported toxRS genes, a set of degenerate primers targeting to relatively conserved regions was designed. A DNA fragment of 864 bp was amplified from the chromosome of V. vulnificus by PCR, and cloned into a cloning vector. The DNA sequence of the insert showed about 60% homology with the Vc-toxRS and Vp-toxRS. With enzymatic restriction and sequence analysis, a HindIII site was found. The DNA fragment was used as an authentic probe for the cloning of toxRS homolog in V. vulnificus (Vv-toxRS). The chromosomal DNA extracted from V. vulnificus ATCC 29307 was digested with various restriction enzymes and analyzed by Southern blotting. The BglII fragments of 4.0 kb and the HindIII fragments of 1.2 and 6.1 kb showing positive signals were used for the chromosomal Vv-toxRS cloning. An 1.6 kb BglII-HindIII fragment and an 1.2 kb HindIII fragment was finally cloned and sequenced. The two fragments with 2,696 bp included 2 open reading frames (ORFs), Vv-toxR and Vv-toxS, showing significant homologies to Vc-toxRS and Vp-toxRS. The intact chromosomal Vv-toxRS fragment was identified and cloned by PCR amplification. The fragments including only the ORF of toxR or toxS was also amplified with PCR and constructed into subclones for the further study. The Vv-toxR DNA sequence shared homologies of 54.7% and 62.0% with the Vc-toxR and Vp-toxR, respectively. At the amino acid level, Vv-ToxR was 55.0% and 63.0% homologous to the Vc-ToxR and Vp-ToxR, respectively. The Vv-toxR showed 64.9% and 66.0% DNA, and 65.7% and 71.5% amino acid sequence homologies with Vc-toxS and Vp-toxS respectively. The Vv-toxRS homologs in other Vibrios were screened by using the cloned Vv-toxRS DNA fragment as a probe through the DNA-colony blot hybridization. All strains of V. vulnificus showed positive signals at high stringency and some other Vibrio species showed weak positive signals at low stringencies but no positivity at high stringency. These results indicate that all V. vulnificus strains have toxRS, and the Vv-toxRS homologs might be generally distributed in other Vibrio species including V. cholerae and V. parahaemolyticus. In conclusion, the Vv-toxRS were successfully identified, cloned, and sequenced and it will be used for studying virulence regulatory mechanisms.

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      목차 (Table of Contents)

      • Table of Content
      • List of Tables = I
      • List of Figures = II
      • 》ABSTRACT《 = 1
      • I. INTRODUCTION = 4
      • Table of Content
      • List of Tables = I
      • List of Figures = II
      • 》ABSTRACT《 = 1
      • I. INTRODUCTION = 4
      • 1. General review = 4
      • 2. The toxRS known as virulence regulatory genes in Vibrio species = 10
      • 3. Strategy for this study = 17
      • II. Section One- Amplification and Cloning of a DNA Fragment of V. vulnificus Homologous to the Vc-toxRS and Vp-toxRS = 18
      • MATERIALS and METHODS = 19
      • RESULTS = 24
      • SUMMARY = 33
      • III. Section two- Cloning and Sequencing of the Chromosomal Vv-toxRS = 34
      • INTRODUCTION = 35
      • MATERIALS and METHODS = 36
      • RESULTS = 53
      • IV. DISCUSSION = 85
      • V. CONCLUSION = 89
      • VI. REFERENCE = 91
      • 》국문초록《 = 101
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