Macrocyclic trichothecene toxins exert anti-melanoma activity through ER stress-mediated apoptosis in mouse melanoma cells

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Macrocyclic trichothecene toxins (MTTs) were extracted from Podostroma cornu-damae, a deadly poisonous mushroom. Although these compounds have been known to possess antifungal, antiviral, and anticancer activities, their anti-melanoma activity has not been reported. Therefore, in this study, anti-cancer activity of MTTs against mouse melanoma cell line (B16F10) and their underlying mechanisms were examined. The isolated compounds (P1−13) were evaluated for cytotoxicity against mouse melanoma cell line (B16F10). P1 (Roridin E, R) and P5 (Satratoxin H, S) exhibited a significant cytotoxicity and reduced cell proliferation. They elevated the expression of Bax and cleaved caspase-3. They also increased intracellular reactive oxygen species (ROS) levels in a dose dependent manner. The cytotoxicity caused by R and S was attenuated after scavenging ROS with glutathione (GSH). In the Autodock analysis, R and S showed high binding affinity with ribosome, indicating their binding to ribosome. R and S upregulated the levels of ER stress biomarkers and activated the unfolded protein response (IRE1, PERK, ATF6). In addition, they induced endoplasmic reticulum (ER) stress and caused caspase-dependent apoptosis following ER stress response. Collectively, these results indicate that R and S can trigger ER stress-mediated apoptosis in melanoma cells, suggesting that they could be introduced as an anti-melanoma strategy.

국문 초록 (Abstract)

붉은 사슴뿔 버섯에서 추출한 대환식 트리코테신 독소 13종을 스크리닝한 결과, Roridin E, Satratoxin H에서 암세포(B16F10)에 대한 유의미한 세포독성 효과를 보였다. 세포사멸을 유도하는데 중요한 역할을 하는 활성산소가 증가하는 것을 확인하였다. 이는 항산화제인 GSH(Glutathione)을 처리하였을 때 트리코테신에 의해 증가하였던 활성산소가 감소하였고, 세포 생존능이 회복되었다. 따라서 활성산소가 트리코테신의 세포사멸에 관여한다는 사실을 확인하였다.
트리코테신의 독성은 세포 내 리보솜에 결합하여 단백질 합성을 억제함으로써 세포독성을 나타낸다. 분자 모델링 시뮬레이션 소프트웨어를 활용해 리보솜과 트리코테신이 결합할 수 있음을 확인했다. 소포체 스트레스가 트리코테신의 세포사멸에 관여하는지 확인했을 때, 소포체 스트레스 관련 mRNA의 발현이 증가하였다. 소포체 스트레스에 대한 반응으로 일어나는 비-접힘 단백질 반응 중 세포사멸에 관여하는 PERK, ATF4의 mRNA 발현이 트리코테신에 의해 증가하였다. 세포사멸 시 소포체와 미토콘드리아를 매개하는 세포질 내 칼슘 농도 또한 트리코테신에 의해 증가하였다. 또한 미토콘드리아 내 활성산소가 증가하고 미토콘드리아 막전위가 탈분극되는 것을 확인하였다. Western Blot을 통해 세포사멸 관련 단백질(Bax, Bcl-2, cleaved caspase3)을 확인했을 때 트리코테신에 의해 세포사멸이 일어남을 확인했다.
트리코테신에 의한 세포 독성은 정상 멜라닌 세포에서는 나타나지 않았고, 선택적으로 흑색종 세포에서만 나타났다. 따라서 트리코테신에 의한 항-흑색종 효과를 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• List of Figures 3
• List of Abbreviations 4
• Abstract 5
• 1. Introduction 7
• 2. Materials and Methods 9
• 2.1 Cell culture 9
• 2.2 Cell viability assay 9
• 2.3 Edu Incorporation Assay 10
• 2.4 BrdU Assay 10
• 2.5 Flou-4 Ca2+ Influx assay 10
• 2.6 DCF-DA assay 11
• 2.7 Annexin V & PI staining 11
• 2.8 MitoSox 12
• 2.9 Real Time polymerase chain reaction (RT-PCR) 12
• 2.10 Western blotting analysis 12
• 2.11 Molecular docking Analysis 13
• 2.12 Statistical Analysis 13
• 3. Results 15
• 3.1 Roridin E and Satratoxin H promote apoptosis in B16 mouse melanoma cells. 15
• 3.2 Roridin E and Satratoxin H induce ER stress by binding to ribosome in B16 mouse melanoma cells. 19
• 3.3 Roridin E and Satratoxin H cause ROS mediated apoptosis in B16 mouse melanoma cell. 23
• 3.4 Roridin E and Satratoxin H trigger ER stress-mediated apoptosis in B16 mouse melanoma cell. 26
• 4. Discussion 30
• References 34
• 논문요약 (국문) 37