Phylogenetic characterization of hantaviruses using multiplex PCR-based next-generation sequencing

국문 초록 (Abstract)

한타바이러스는 외피를 가지는 단일 가닥의 음성 RNA 바이러스이다. 한타바이러스는 감염된 쥐의 소변, 대변 및 타액으로부터 노출된 바이러스 입자가 건조되어 공기중에 떠다니다 호흡기를 통해 사람에게 감염되어 신증후출혈열 및 한타바이러스 폐 증후군을 일으킨다. 최근에 차세대염기서열분석법 (NGS, Next-generation sequencing)의 상용화에 따라 여러 연구 분야에서 다양하게 NGS가 적용되고 있다. 특히, 신출현 바이러스를 규명하기 위해서는 바이러스로부터 전장유전체를 획득하여 바이러스의 전파를 분석하는 것은 매우 중요하다. 그러나 바이러스의 감염 상태에 따라 바이러스 농도가 낮거나, 시료 내에 바이러스의 양이 극미세소량으로 존재할 수 있기 때문에 일반적인 NGS 실험 방법으로는 바이러스의 전장 유전체 서열을 획득하는 것이 어렵다. 따라서 이 연구에서는 한탄, 서울, 수청바이러스 감염시료로부터 바이러스 유전체 획득을 위한 NGS 방법을 확립하고자 한다. 우선적으로 한탄바이러스를 매개하는 등줄쥐 시료에서 바이러스의 전장 유전체 서열 획득을 위해 3가지의 NGS 방법 (SISPA, RNA access, Multiplex PCR)을 개발하고 비교 분석했다. 등줄쥐 시료 내의 한탄바이러스 농도에 따라서 유전체 획득률을 비교하였을 때, Multiplex PCR에 기반한 NGS 방법이 바이러스 유전체 서열 확보에 있어 최적의 방법임을 확인하였다. 최근 미국과 영국에서 애완용으로 기르는 쥐로부터 서울바이러스에 감염되는 사례가 확인되기도 하여 감염병에 대한 대비가 필요하다. 따라서, 이 연구에서는 서울바이러스에 특이적인 Multiplex PCR에 기반한 NGS 방법을 확립함으로써 서울바이러스 감염으로 인한 신증후출혈열 환자의 혈청과 서울바이러스에 감염된 시궁쥐 조직으로부터 서울바이러스 유전체 획득을 가능하게 하였다. 얻어진 유전체 염기서열을 이용하여 계통학적분석을 진행한 결과, 기존의 연구들에서 규명되지 않았던 서울바이러스의 발생지역에 따른 유전 분류 및 전세계적인 분포 형태를 밝혔으며 자연 상태에서 서울바이러스에 대한 유전자 재편성 현상의 가능성을 확인했다. 수청바이러스는 현재까지 인간에게 질병을 일으키는지 확인되지 않았다. 그러나, 한국에서 발생하는 신증후출혈열 환자의 10%는 한탄바이러스와 서울바이러스가 아닌 다른 한타바이러스로 인한 감염으로 인해 발생된다고 알려져 있다. 따라서 수청바이러스를 매개하는 흰넓적다리붉은쥐에서의 수청바이러스 유전체 연구 또한 필요한 시점이다. 이 연구에서는 수청바이러스에 특이적인 Multiplex PCR에 기반한 NGS 방법을 통해 흰넓적다리붉은쥐 뿐만 아니라 등줄쥐에서도 수청바이러스 유전체를 획득하였다. 그 결과, 국내 수청바이러스의 유전적 다양성 및 지리적 분포 형태를 밝혔다. 결론적으로 이 연구에서 확립한 Multiplex PCR에 기반한 NGS 방법은 극미세소량의 바이러스 RNA를 가지는 시료로부터 한타바이러스 유전체 획득을 가능하게 하여 조기 진단에 적용될 수 있을 것이라 생각된다. 또한 한타바이러스의 유전자 정보 기반의 진화적 분석에 기초를 제공할 뿐만 아니라 설치류 매개 한타바이러스의 다발생에 대비한 감시 체계 구축에 기여할 수 있을 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Orthohantaviruses are enveloped, negative-sense, single-stranded RNA viruses. They are transmitted to humans when viral infectious particles from the excreta of infected rodents are inhaled through the respiratory tract. In humans, orthohantaviruses cause two types of clinical diseases, which are hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) and hantavirus pulmonary syndrome. Next-generation sequencing (NGS) has been applied for various analyses in virology. In particular, it is very important to analyze the spread of the virus by acquiring whole-genome sequences in order to identify the emerging virus. However, it is very difficult to obtain genomic sequences for clinical specimens or wild rodents with low virus levels. Therefore, this study aims to establish NGS methods for the acquisition of viral genomes from specimens infected with Hantaan orthohantavirus (HTNV), Seoul orthohantavirus (SEOV) and Soochong virus (SOOV). Thus, different NGS methods have been attempted obtaining the genomic sequences of HTNV from lung tissues of wild rodents. The coverage rate of HTNV tripartite genomes was compared and analyzed according to the viral copy number. As a result, multiplex PCR-based NGS is the most robust method for acquiring the genomic sequences of HTNV. Recently, outbreaks of SEOV-induced HFRS have been reported from pet rats in the United States and the United Kingdom; thus, it is required to prepare for infectious diseases. Thus, this study established the SEOV multiplex PCR-based NGS method, enabling the acquisition of SEOV genomes from HFRS patients caused by SEOV infection and SEOV-infected rats. Phylogenetic analysis revealed the genetic diversity and distinct genotypes around the world and identified the possible occurrence of genetic exchange (genetic reassortment) of SEOV. The pathogenicity of SOOV still remains to be understood in humans. About 70% of HFRS patients were infected with HTNV, 20% were infected with SEOV, and the remaining 10% of the cases were infected by unidentified agents. To identify the other HFRS-causing orthohantaviruses, it is necessary to investigate the prevalence of SOOV infection in the Korean field mouse. In this study, the multiplex PCR-based NGS of SOOV was used to obtain SOOV genomes not only in the Korean field mouse but also in the striped field mouse. Phylogenetic analysis of SOOV genomic sequences revealed geographic distribution and genetic diversity in South Korea. In conclusion, multiplex PCR-based NGS can be applied to early diagnosis by enabling viral genome acquisition from specimens with low virus titers. This study provides useful insights into NGS methods for whole-genome sequencing, surveillance and HFRS diseases risk assessment of rodent-borne orthohantaviruses.

목차 (Table of Contents)

• Abstract (English) 1
• Abstract (Korean) 3
• List of tables 6
• List of figures 8
• Abbreviation 10
• Chapter 1. Establishment of genome acquisition method
• using next-generation sequencing for Hantaan orthohantavirus 11
• 1.1. Introduction 11
• 1.2. Materials and methods 14
• 1.2.1. Ethics statement 14
• 1.2.2. Indirect Immunofluorescence antibody assay (IFA) 14
• 1.2.3. RNA extraction and cDNA synthesis 14
• 1.2.4. Nested PCR for Hantaan orthohantavirus 15
• 1.2.5. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) 15
• 1.2.6. Quantitation of Hantaan orthohantavirus genome copy 16
• 1.2.7. Sequence-independent, single-primer amplification (SISPA) 17
• 1.2.8. RNA access-based NGS for Hantaan orthohantavirus 17
• 1.2.9. Multiplex PCR for Hantaan orthohantavirus 18
• 1.2.10. Library preparation and NGS 18
• 1.2.11. NGS data analysis 19
• 1.2.12. Phylogenetic analysis 19
• 1.3. Results 20
• 1.3.1. Epidemiologic surveillance of Apodemus agrarius for Hantaan orthohantavirus 20
• 1.3.2. Sample selection 22
• 1.3.3. Determination of Hantaan orthohantavirus RNA copy number in rodents 23
• 1.3.4. Viral loads of Hantaan orthohantavirus in seropositive rodents 25
• 1.3.5. Coverage rate of genomic sequences of Hantaan orthohantavirus obtained by different NGS methods 26
• 1.3.6. Comparison of Hantaan orthohantavirus reads in the total reads based on different NGS methods 28
• 1.3.7. Phylogenetic analysis of Hantaan orthohantavirus 33
• Chapter 2. Establishment of genome acquisition method
• using next-generation sequencing for Seoul orthohantavirus 35
• 2.1. Introduction 35
• 2.2. Materials and methods 37
• 2.2.1. Ethics statement 37
• 2.2.2. Indirect Immunofluorescence antibody assay (IFA) 37
• 2.2.3. RNA extraction and cDNA synthesis 37
• 2.2.4. Nested PCR for Seoul orthohantavirus 38
• 2.2.5. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) 38
• 2.2.6. Quantitation of Seoul orthohantavirus RNA genome copy 39
• 2.2.7. Multiplex PCR for Seoul orthohantavirus 39
• 2.2.8. Library preparation and NGS 40
• 2.2.9. NGS data analysis 40
• 2.2.10. Phylogenetic analysis 40
• 2.3. Results 41
• 2.3.1. Epidemiologic surveillance of Rattus norvegicus for Seoul orthohantavirus 41
• 2.3.2. Sample selection 43
• 2.3.3. Determination of Seoul orthohantavirus RNA copy number in rats 44
• 2.3.4. Viral loads of Seoul orthohantavirus in seropositive rats 46
• 2.3.5. Coverage rate and depth of Seoul orthohantavirus genomic sequences based on multiplex PCR-based NGS 47
• 2.3.6. Phylogenetic analysis of Seoul orthohantavirus 50
• Chapter 3. Establishment of genome acquisition method
• using next-generation sequencing for Soochong virus 54
• 3.1. Introduction 54
• 3.2. Materials and methods 56
• 3.2.1. Ethics statement 56
• 3.2.2. Indirect Immunofluorescence antibody assay (IFA) 56
• 3.2.3. RNA extraction and cDNA synthesis 56
• 3.2.4. Nested PCR for Soochong virus 57
• 3.2.5. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) 57
• 3.2.7. Multiplex PCR for Soochong virus 59
• 3.2.8. Library preparation and NGS 59
• 3.2.9. NGS data analysis 59
• 3.2.10. Phylogenetic analysis 59
• 3.3. Results 61
• 3.3.1. Serologic and molecular screening for Soochong virus 61
• 3.3.2. Sample selection 64
• 3.3.3. Determination of Soochong virus RNA copy number in rodents 65
• 3.3.4. Viral loads of Soochong virus in rodents 67
• 3.3.5. Coverage rate and depth of Soochong virus genomic sequences based on multiplex PCR-based NGS 68
• 3.3.6. Phylogenetic analysis of Soochong virus 71
• Discussion 79
• References 85