인산 대사 관련 유전체의 특성 규명 = Molecular Characterization of Phosphate Metagenome

국문 초록 (Abstract)

PhoB는 pho regulon의 response regulator 단백질이다. 환경내 phosphate(Pi)가 제한될 때 PhoR은 PhoB 단백질을 인산화하고 인산화된 PhoB는 pho regulon의 하위 유전자들을 활성화 한다. Enterobacteraceae속 phoBR의 보존된 염기서열을 이용하여 primer를 제작하여 8균주로부터 PCR 클로닝한 phoBR 유전자들에 대한 염기서열을 결정하고 분석하였다. 각 균주의 phoB 유전자의 염기서열에 대한 상동성을 비교한 결과 각각 82%∼99%의 유사성이 있었고, 아미노산 서열을 비교 분석한 결과, 95%∼100%의 상동성을 보였다. 또한 phoR 유전자의 경우 95%∼100%의 유사성을 보였으며, PhoR 단백질은 83∼100%의 상동성을 보였다. Enterobacter aerogenes의 PhoB 단백질의 보존된 acidic residues(아미노산 서열 9∼11번째)를 site-directed mutation 시켰다. pBluescriptII vector에 클로닝된 phoB mutant들을 E. coli에 형질 전환시켜 phosphate를 starvation시킨 후 BAP(bacterial alkaline phosphatase) test를 수행한 결과, E9Q와 E11A의 double mutant에서 low Pi 뿐만 아니라 high Pi 상태에서도 pho regulon에 속하는 유전자를 유도하는 PhoB^(c)(constitutive PhoB)를 확보하였다. Proteomic profiling 연구를 통하여 PhoB의 constitutive한 발현에 따른 단백질의 변화 양상을 확인하였다.
Ent. aerogenes의 BAP 유전자인 phoA를 클로닝하여 염기서열을 결정하였고 phosphate starvation 하에서 Ent. aerogenes도 E. coli의 phoA(BAP)처럼 합성이 유도되어지는 것을 BAP assay를 통하여 확인하였다. 또한 PhoA-CAT assay(PhoA promoter 활성측정)를 통하여 phosphate limitation시 transcriptional activator인 PhoB 단백질에 의해 활성이 유도되는 것을 확인하였다. Ent. aerogenes의 phoA유전자의 down stream에는 E. coli K-12에서와 같이 psiF(unknown function)와 proC 유전자가 존재하였다.
pho box(CTGTCATTTTTTTGTCAC)와 -10(TAAAGT)을 결정하였고 다른 박테리아의 PhoA와 아미노산 서열을 비교한 결과, Shi. dysenteriae (ZP00921794)와 87%의 상동성을 E. coli(AAA24364)와는 86%의 상동성을 가지고 있었다. PsiF 단백질의 경우 Shigella(NP706148) 그리고 E. coli(NP494918)와 66%의 상동성을 가지고 있었다. T7 promoter 과발현 시스템을 이용하여 PhoA를 과발현 시키고 His-tag으로 정제한 후, Ent. aerogenes의 phoA 유전자 산물의 분자량을 확인한 결과 57 kDa인 것을 확인하였다. SDS-PAGE상에서 단백질을 refolding 시킨 후 α-naphythyl phosphate과 XP solution을 처리하여 AP+(BAP) 단백질의 특성을 확인하였다.
Phosphonates(Pn)은 C-P 공유결합을 가지고 있는 난분해성 인산염이다. 본 연구에서 C-P화합물에 대하여 분해능이 있는 것으로 탐색·선별된 7균주를 형태적, 생리·생화학적 특성 그리고 분자생물학적 특징을 연구하여 분류·동정을 하였다. 16S rDNA를 클로닝한 후 염기서열을 분석하였고 7균주간의 상동성에 대하여 비교·분석하였다. KSL1은 Klebsiella oxytoca로, KSL6과 KSL7은 Ent. amnigenus로 KSL9는 Citrobacter freundii로, KSL10과 KSL101은 Leclercia adecarboxylata로, KSL105는 Rhizobium sp로 동정하였다. 또한 C-P lyase gene cluster를 확인하기 위하여 primer를 제작하여 polymerase chain reaction과 Southern blot을 이용하여 C-P lyase 유전자들의 존재를 확인하였다. 각 균주에 따라 부분적으로 phn 유전자의 염기서열을 결정하였다. KSL9(Citrobacter freundii)의 MPn 분해시, proteomic profiling method를 이용하여 단백질 발현의 변화를 확인 하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

PhoB is the response regulator of the pho regulon. When environmental Pi becomes limiting, PhoR transduces this signal, phosphorylating PhoB and the phosphorylated PhoB then activates transcription of genes in the pho regulon.
The specific oligonucleotide primers(genus of Enterobacteraceae for phoBR) were used to amplify by the polymerase chain reaction (PCR) and sequenced. The results showed comparative analysis across 8 strains revealed conserved phoBR genes by sequencing. The homology of 82%∼99% identies in nucleotide sequences compared with phoB gene among strains and 95%∼100% homology in the amino acid sequence with PhoB. The phoR are 76%∼100% identies and PhoR are 83%∼100% homologue respectively. Phylogenetic tree is suggested the evolution of phoBR genes. The site-directed mutations were introduced at the conserved acidic residues in the regulatory domain of Ent. aerogenes PhoB. The pBluescriptII vectors with the phoB mutants and its promoter were transferred into E. coli strains and determined the alkaline phosphatase activities in the high and low phosphate media. Among the mutants, E9Q and E11A double mutant showed the constitutively activation at high and low phosphate conditions. The paper discussed the enzymatic responses of the mutants by protein profiling method.
Also, we cloned and sequenced the phoA gene encoding bacterial alkaline phosphatase from Ent. aerogenes. The phoA gene is a member of pho regulon genes which are induced under the phosphate limitation and acivated by transcriptional activator PhoB protein by CAT assay. In the down stream of phoA, psiF(unknown function) and proC genes were also found like the gene order in E. coli. The pho box(CTGTCATTTTTTTGTCAC) and -10(TAAAGT) region in phoA promoter region were also found out in the paper. Amino acids of PhoA and PsiF were campared among other bacterial species. On the basis of BLAST analysis, the PhoA is shown to have 87% and 86% homology in amino acid sequence with Shi. dysenteriae(ZP00921794) and E. coli(AAA24364). The PsiF is shown to have 66% similarity in amino acid sequence with Shigella(NP706148) and E. coli(NP494918) but Salmonella(YP151536) is shown to have 65% similarity. PhoA were used to purified by the His-tag and then it was detected from the SDS-PAGE. The molecular weight determinated 57kDal. After reactivation of the gel, PhoA detection were found after using the alkaline phosphate substrate, α-naphythyl phosphate and XP.
Phosphonates (Pn) are characterized by a carbon atom covalently bonded to phosphorus. In order to determine the taxa of those C-P compound degradation bacteria, the 16S ribosomal DNAs (rDNAs) were cloned and sequenced. Using the BLAST and ClustalW Program, phylogenic trees, genetic similarities and multiple sequence alignments of 16S rDNAs were analyzed and identification of bacteria on the basis of Bergey's manual was carried out. The seven C-P compound degradation bacteria were identified as follows : KSL6 and KSL7 are Ent. amnigenus, KSL10, and KSL101 are Leclercia adecarboxylata, KSL1 is Klebsiella oxytoca, KSL9 is Citrobacter freundii, KSJ105 is Rhizobium sp.. Also C-P lyase genes were cloned from KSL1, KSL6, KSL7, KSL9, KSL10, KSL101 and KSL105 by polymerase chain reaction and southern blot, partially sequenced genes of the phn operon. The paper discussed the protein responses of the KSL9(Citrobacter freundii) by use of proteomic profiling method when MPn was degraded.

목차 (Table of Contents)

• 국문요지 = ⅰ
• 목차 = ⅲ
• LIST OF TABLES = ⅸ
• LIST OF FIGURES = xii
• List of Abbreviations = xix
• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. phoBR 유전자 탐색 및 특성규명 = 11
• A. 서론 = 11
• B. 재료 및 방법 = 13
• 1. 배지 및 chemicals = 13
• 2. 균주, phage 및 plasmid = 13
• 3. phoBR 유전자 클로닝. = 13
• 3-1. complementation test = 14
• 3-2. Polymerase chain reaction 및 반응산물의 클로닝 = 14
• 4. 유전자의 염기서열 결정 및 분석 = 15
• 5. PhoB의 constitutive form(phoB^(c))에 관한 연구 = 15
• 5-1. Site-directed mutagenesis = 15
• 5-2. PhoB^(c) mutant에 대한 BAP 활성 분석 = 16
• 5-3. Proteomic profiling = 17
• C. 결과 및 고찰 = 18
• 1. Enterobacter aerogenes의 phoBR 유전자 = 18
• 1-1. Complementation test = 18
• 1-2. Ent. aerogenes phoBR 유전자 염기서열 분석 = 19
• 1-3. Ent. aerogenes phoBR에 대한 site-directed mutagenesis = 20
• 1-4. PhoB^(c) mutant에 대한 BAP 활성 분석 = 20
• 1-5. Proteomic profiling = 23
• 1-5-1. PhoB wild type을 발현시 low phosphate와 high phosphate의 단백질 변화 = 24
• 1-5-2. PhoB^(C)를 발현시 low phosphate와 high phosphate의 단백질 변화 = 24
• 1-5-3. Low phosphate에서 PhoB^(C)와 PhoB 발현시 단백질 변화 = 24
• 1-5-4. High phosphate에서 PhoB^(C)와 PhoB 발현시 단백질 변화 = 25
• 1-5-5. PhoB^(C)와 PhoB의 발현을 통한 proteomic profiling = 25
• 2. Leclercia adecarboxylata KSJ8의 phoBR 유전자 = 26
• 2-1. Complementation test = 26
• 2-2. Southern blot을 이용한 phoBR 유전자 확인. = 26
• 2-3. L. adecarboxylata KSJ8의 phoBR 유전자 cloning = 27
• 2-4. Alkaline phosphatase activity 측정 = 27
• 2-5. L. adecarboxylata KSJ8의 phoBR 염기서열 분석 = 28
• 3. C-P화합물 분해능을 가진 박테리아 phoBR 유전자 탐색 = 28
• Ⅲ. Alkaline phosphatase, phoA gene = 97
• A. 서론 = 97
• B. 재료 및 방법 = 99
• 1. 배지 및 chemicals. = 99
• 2. 균주 및 plasmid = 99
• 3. 제한효소 = 100
• 4. Competent cell의 제조 및 형질 전환 = 100
• 5. Plasmid의 분리 = 101
• 6. Chloramphenicol acetyltransferase assay(CAT assay) = 101
• 7. 염기서열분석 및 상동성 분석 = 102
• 8. PhoA 과대발현 및 정제 = 102
• 9. Silver staining = 103
• 10. SDS-PAGE상에서 PhoA 검출 = 103
• C. 결과 및 고찰 = 105
• 1. phoA유전자의 클로닝 = 105
• 2. 염기서열분석 및 상동성 분석 = 105
• 3. Chloramphenicol acetyltransferase assay = 105
• 4. His-tag을 이용한 PhoA의 분리정제 = 106
• 5. SDS-PAGE상에서 alkaline phosphatase 검출 = 106
• Ⅳ. C-P 화합물 분해세균 = 119
• A. 서론 = 119
• B. 재료 및 방법 = 122
• 1. 균주 및 Plasmid = 122
• 2. 배지 = 122
• 3. C-P 화합물 분해능 세균 탐색 = 122
• 4. 생리·생화학적 특성 조사 = 122
• 5. Genomic DNA 추출 = 123
• 6. Primer의 제작 = 123
• 7. PCR에 의한 증폭 및 Cloning = 124
• 8. C-P lyase gene probe 준비 = 125
• 9. C-P lyase gene cluster에 대한 Southern Blot 분석 = 125
• 10. Polymerase chain reaction을 통한 C-P lyase gene cluster 확인 = 126
• 11. Proteomic profiling = 126
• C. 결과 및 고찰 = 128
• 1. C-P 화합물 분해능 = 128
• 2. C-P화합물 분해 균주의 가스 생성능 확인 = 129
• 2-1. MPn, AEPn, DMPt, HPt, Glyphosate분해능 확인 = 129
• 3. 16S rDNA의 클로닝 및 염기서열 결정 = 130
• 4. Screening된 C-P 화합물 분해 균주의 분류·동정 = 132
• 4-1. KSL6, KSL7, KSL10, KSL101 균주의 동정 = 132
• 4-2. KSL1 균주의 동정 = 133
• 4-3. KSL9 균주의 동정 = 134
• 4-4. KSL105 균주의 동정 = 135
• 5. C-P화합물 분해 균주의 생화학적 특성 = 136
• 5-1. Gram staining = 136
• 5-2. Catalase test = 137
• 5-3. Oxidase test = 137
• 5-4. Phenylalanine agar = 138
• 5-5. Starch hydrolysis agar = 138
• 5-6. Hydroapatite agar = 138
• 5-7. Triple sugar iron agar = 138
• 5-8. Kliger iron agar = 139
• 5-9. Simmons citrate agar = 140
• 5-10. MR-VP broth = 140
• 5-11. Aseculin = 141
• 5-12. Peptone water(indole production test) = 142
• 5-13. Urea broth = 142
• 5-14. Moller's decarboxylase test. = 142
• 5-15. Phenol red carbohydrate test. = 143
• 5-16. EC medium = 144
• 5-17. R2A agar = 144
• 5-18. Peptone iron agar = 144
• 5-19. Actinomy isolation agar = 144
• 5-20. TCBS agar = 145
• 5-21. Bacto KF agar = 145
• 5-22. SS agar = 145
• 5-23. Bacto EMB agar = 145
• 5-24. Macconkey agar = 146
• 5-25. Hydroxyapatite agar = 146
• 5-26. 항생제에 대한 내성 확인 = 146
• 6. Southern blot을 이용한 C-P lyase gene cluster 확인 = 148
• 7. PCR을 통한 C-P lyase gene cluster 확인 = 150
• 7-1. phn2up primer와 phn6 down primer(phnF 710∼phnP 320bp) = 150
• 7-2. phn2up primer와 phn5down primer(phnF 710∼phnM 80bp) = 150
• 7-3. phn2up primer와 phn4down primer(phnF 710∼phnJ 520bp) = 150
• 7-4. phn4up primer와 phn5down primer(phnJ 520∼phnM 130bp) = 151
• 7-5. phnCup primer와 phnDdown primer(phnC 641∼phnD 816bp) = 151
• 7-6. phnCup primer와 phn4down primer(phnC 641∼phnJ 520bp) = 152
• 7-7. phnCup primer와 phn6down primer(phnC 641∼phnP 320bp) = 152
• 7-8. phn2up primer와 phn3down primer(phnF 710∼phnI 255bp) = 152
• 7-9. phn3up primer와 phn4down primer(phnI 170∼phnJ 530bp) = 153
• 7-10. phn4up primer와 phn5down primer(phnJ 520∼phnM 140bp) = 153
• 7-11. phn5up primer와 phn6down primer(phnM 140∼phnP 320bp) = 153
• 7-12. KSL9 phn cluster의 각 유전자에 대한 PCR 확인 = 154
• 8. C-P lyase gene 클로닝 및 염기서열 분석 = 155
• 9. C-P화합물 분해 균주들의 성장에 따른 AP와 Pi의 변화 = 158
• 10. Proteomic profiling = 159
• Ⅴ. 결론 = 269
• 참고문헌 = 279
• 영문요약 = 289
• 감사의 글 = 293