지유 발효추추물의 향균효과 및 항산화활성에 관한 연구 = Studies on the Antimicrobial Effect and Antioxidative Activity of Fermented Sanguisorbae Radix Extract

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study was conducted to investigate the antimicrobial effect, antioxidative activity and cytotoxicity of Sanguisorbae Radix extract and fermented Sanguisorbae Radix extract.
Sanguisorbae Radix containing saponin embryo sac, pomolic acid, vitamin A, triterpenoides, tannin, and phenolic acid have several different functions, such as high blood pressure restraint, gout protection, antioxidative effect and anticancer.
In this respect, the following showed the results about antibacterial activity, antioxidant activity and cytotoxicity of fermented Sanguisorbae Radix extract.
1. Antibacterial activity of Sanguisorbae Radix extract was different according to declared bacteria, and looked on against B. subtilis, B. cereus, V. parahaemolyticus, S. aureus. antibacterial activity of fermented Sanguisorbae Radix extract appeared relatively highly against B. cereus and S. aureus and didn't show any difference.
2. The experiment results to find out the minimum inhibition concentration showed that if not fermented, there existed antibacterial activity in 5 percents concentration, and if fermented, 10 percents concentration.
3. Sanguisorbae Radix extract was safe from heat. It showed high antibacterial activity within the range of pH 3 to pH 7 but had been reduced within the range of pH 9 to pH 11.
4. The result of antibacterial activity with fractions of Sanguisorbae Radix extract looked on highly against B. cereus, B. subtilis, S. aureus, V. parahaemolyticus in water, n-BuOH, and EtOAc fractions and antibacterial activity with fraction concentration of extract had in over 5 percents.
5. Antifungal activity of Sanguisorbae Radix extract was lower than that of antibacterial activity, and antifungal activity was discovered against F. solani, R. solani, A. panax, C. gloeosporioides, P. expansum. The result of antifungal activity with various concentration had in even 10 percents concentration against F. solani, R. solani, and C. gloeosporioides.
6. Total flavonoid content of Sanguisorbae Radix extract showed over 65㎎/g regardless of fermentation, and it had been decreased after fermentation. Total polyphenol content expressed over about 20㎎/g, and it had been increased after fermentation.
7. Electron donating ability in comparison to Vitamin C showed over 90 percents' activity at about the same time, and antioxidative activity of Sanguisorbae Radix extract expressed highly. Superoxide dismutase-like activity showed 15 percents in fermentation before and after. So both electron donating ability and superoxide dismutase-like activity didn't show a special difference.
8. Nitrite scavenging ability expressed high activity, over 70 percents in 2.5 pH of an acid condition which was similar to the stomach of the body and showed higher activity than that of BHT. Also it will be able to be used for making inflammatory body's disease get better and be treated because it had the effect which prevents nitric oxide generating.
9. Sanguisorbae Radix extract had function that prevents generating lipid peroxidation in not only fibrolast cell but also HepG2 cell. Restraining lipid peroxidation immediately reduced MDA form and protected liver cell. With this reasons, it will be worth studying further and applying in the future.
10. Fermented Sanguisorbae Radix extract in 10㎍/㎎ concentration showed that there had the effect of Raw 264.7 cell activity, but in over 50㎍/㎎ concentration, there had no the effect of Raw 264.7 cell activity. In the effect of increasing fibrolast cell, made fibroblast cell growth rate higher than that of a contrast group in all of concentration. Therefore, it was summarized that the cytotoxicity of Sanguisorbae Radix extract appeared lowly. The cytotoxicity of HepG2 cell expressed the highest in from 10 to 50㎍/㎎ concentration. So with the reason why fibroblast cell as well as HepG2 cell showed a high cell viability over 80 percents in even a lot higher density, it should be apply to various fields as biological activities.

국문 초록 (Abstract)

사포닌배당체, pomolic acid, 비타민 A, triterpenoides, 탄닌, phenolic acid 등을 함유하고 있어 고혈압 억제, 통풍예방, 항산화 효과, 항암 등의 여러 생리활성 기능이 있는 것으로 알려져 있는 지유 발효추출물의 항균활성, 항산화활성 및 세포독성을 조사한 결과는 다음과 같다.
1. 지유 추출물의 항세균활성은 공시 세균에 따라 차이가 있었으며, B. subtilis, B. cereus, V. parahaemolyticus, S. aureus 에 대해서 항균활성이 관찰되었고, 발효추출물의 항세균활성은 B. cereus 와 S. aureus 등 2종에서 항균활성이 비교적 높게 나타났으며 발효에 따른 항균활성의 유의적 차이는 없었다.
2. 최소저해 농도를 알아보기 위한 실험결과 발효하지 않은 경우는 5%, 발효한 처리구는 10%농도에서 항균활성이 있었다.
3. 지유추출물은 열에 안정한 것으로 생각되며, pH 3~pH 7의 범위에서는 높은 항균활성을 나타내었으나 pH 9~pH 11의 범위에서는 항균활성이 감소하였다.
4. 추출 분획물에 따른 항세균활성을 조사한 결과 water, n-BuOH, EtOAc 층에서 B. cereus, B. subtilis, S. aureus, V. parahaemolyticus에 대해 높은 항균활성이 있었으며, 추출 분획물의 농도에 따른 항균활성은 5%이상의 농도에서 관찰되었다.
5. 지유 추출물의 항진균활성은 세균에 대한 활성보다 낮게 나타났으며, F. solani, R. solani, A. panax, C. gloeosporioides, P.expansum에 대해서 항균활성이 관찰되었고, 농도별 항진균활성을 조사한 결과 F. solani, R. solani, C. gloeosporioides에 대해서 각 분획물의 10% 농도에서도 항균활성이 있었다.
6. 지유추출물의 총 플라보노이드 함량은 발효의 유무에 관계없이 약 65㎎/g 이상이었으며, 발효에 의한 총 플라보노이드 함량은 감소하였다. 총폴리페놀 함량은 약 20㎎/g이상이었으며 발효후에는 증가하였다.
7. 전자공여능은 Vitamin C와 비교할 때 발효 전 후 모두 90%이상의 활성을 보여 지유추출물의 항산화능이 높게 나타났으며, SOD유사 활성 능력은 발효 전 후 약 15%였다. 전자공여능과 SOD유사 활성 모두 발효에 의한 유의적 변화는 없었다.
8. 아질산염 소거능은 인체의 위와 비슷한 산성조건인 pH 2.5에서 70% 이상의 높은 활성을 나타내었으며, 대조군인 대표적 인공항산화제 BHT보다 높은 활성을 나타내어 nitric oxide의 생성을 억제하는 효과가 있으므로 염증성 인체질환의 개선 및 치료에 이용할 수 있는 물질이라 사료된다.
9. 지유 추출물은 섬유아세포에서나 간암세포에서 과산화지질의 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 지질과산화의 억제는 곧 MDA 형성의 감소와 관련되고 간세포 보호 작용이 있다는 것을 의미한다고 알려져 있기 때문에 이러한 결과는 응용가치가 높을 것으로 사료되며 좀 더 자세한 연구가 있어야 할 것으로 판단된다.
10. 10㎍/㎎ 농도의 발효추출물은 대식세포 활성화효과가 있었으나, 50㎍/㎎ 이상의 농도에서는 오히려 대식세포 활성화효과는 없었다. 섬유아세포의 증식에 미치는 영향은 모든 농도에서 대조구보다 섬유아세포의 생장율이 높게 나타나, 지유추출물의 세포독성이 낮은 것으로 생각되었으며, 간암세포독성은 10~50㎍/㎎의 농도에서 가장 높게 나타났다. 섬유아세포나 간암세포에서 고농도에서도 80% 이상의 높은 세포생존율을 나타내어 여러 분야에서 생리활성 물질로서의 이용이 가능할 것으로 추론된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 14
• 2.1 실험재료 14
• 2.1.1 실험약재 14
• 2.1.2 시약 및 기기 15
• 2.1.3 사용균주 및 배지 15
• 2.1.4 사용 세포주 16
• 2.2 실험방법 17
• 2.2.1 추출물의 조제 17
• 2.2.2 발효추출물 조제 17
• 2.2.2.1 조효소 조제 17
• 2.2.2.2 추출물 발효 17
• 2.2.3 추출물의 항균활성 18
• 2.2.3.1 추출물의 항세균활성 검색 18
• 2.2.3.2 추출물의 항세균활성 18
• 2.2.3.3 추출물의 분획별 항세균활성 19
• 2.2.3.4 추출물의 pH에 따른 항세균활성 20
• 2.2.3.5 추출물의 열안정성 검정 20
• 2.2.3.6 최소저해농도(MIC) 20
• 2.2.3.7 추출물의 항진균활성 21
• 2.2.3.8 추출 분획물의 항진균활성 21
• 2.2.4 항산화활성 검정 22
• 2.2.4.1 총 폴리페놀 함량 측정 22
• 2.2.4.2 총 플라보노이드 함량 측정 22
• 2.2.4.3 DPPH free radical 소거활성 측정 23
• 2.2.4.4 아질산염 소거작용 측정 23
• 2.2.4.5 SOD 유사활성 측정 24
• 2.2.5 세포시험 25
• 2.2.5.1 세포배양 25
• 2.2.5.2 Nitric oxide(NO)생성량 측정 25
• 2.2.5.3 Lipid peroxide(LPO)생성량 측정 25
• 2.2.5.4 세포독성 검정 27
• 2.2.6 통계처리 27
• Ⅲ. 결과 및 고찰 28
• 3.1 추출물의 항균활성 28
• 3.1.1 추출물의 항세균활성 검색 28
• 3.1.2 추출물의 항세균활성 30
• 3.1.2.1 추출물의 농도별 시간경과에 따른 항세균활성 30
• 3.1.2.2 발효 추출물의 항세균활성 33
• 3.1.2.3 발효 추출물의 농도별 항세균활성 37
• 3.1.2.4 추출물의 열처리에 따른 항세균활성 39
• 3.1.2.5 추출물의 pH변화에 따른 항세균활성 42
• 3.1.2.6 추출 분획물의 항세균활성 46
• 3.1.2.7 추출 분획물의 농도별 항세균활성 47
• 3.1.3 추출물의 항진균 활성 50
• 3.1.3.1 추출물의 농도별 항진균 활성 50
• 3.1.3.2 추출 분획물의 농도별 항진균 활성 50
• 3.2 추출물의 항산화 활성 53
• 3.2.1 추출물의 총 플라보노이드 함량 53
• 3.2.2 추출물의 총 폴리페놀 함량 54
• 3.2.3 추출물의 Electron Donating Activity 55
• 3.2.4 추출물의 SOD유사활성 57
• 3.2.5 추출물의 아질산염 소거능 58
• 3.3 세포시험 60
• 3.3.1 Raw 264.7 cell에서 NO생성에 대한 추출물의 영향 60
• 3.3.2 Fibroblast cell 및 HepG2 cell에서 LPO 생성에 대한 추출물의 영향 62
• 3.3.3 세포독성 64
• 3.3.3.1 추출물 처리에 의한 Fibroblast cell의 생존율 64
• 3.3.3.2 추출물 처리에 의한 HepG2 cell의 생존율 66
• Ⅳ. 종합고찰 68
• Ⅴ. 적요 74
• 참고문헌 76
• ABSTRACT 92