라이소자임-덱스트란 결합물의 기능성 = Functional Properties of Lysozyme-Dextran Conjugates

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 난백 라이소자임의 유화성 및 용균성을 향상시키기 위한 방법으로 화학약품을 사용하지 않고 Maillard 반응을 이용한 라이소자임-덱스트란(천연 덱스트란을 효소분해시킨 것) 결합물을 얻은 다음 여러 조건하에서 유화성 및 용균성 변화를 조사하였다.
라이소자임-덱스트란 결합물은 중량비 1:2 비율로 상대습도 80%, 60℃에서 16일간 반응시켜 만들었다. 합성된 라이소자임-덱스트란 결합물의 정제는 Sephacryl S-300을 이용한 젤 여과로 얻은 분획을 투석(48시간, 4℃)한후 동결건조하였다. 트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)을 이용하여 결합물의 유리 아미노기 결합율 측정 결과는 26.2%이였다. 즉 라이소자임 1 분자당 덱스트란 약 2 분자가 결합한 것으로 나타났다.
SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기이동법으로 측정한 라이소자임-덱스트란 결합물의 분자량은 45 kD이었다. Micrococcus lysodeikticus 세포벽을 기질로 했을 때 반응 최적온도는 50℃, 반응 최적농도는 0.4 mg/㎖였고 Lineweaver-Burk 플로트에 의한 K_(M)값은 8.16×10^(-6) M, k_(cat)값은 4.85×10^(-2) min^(-1), k_(cat)/K_(M)값은 5.93×10^(3) M^(-1) min^(-1)이었다.
라이소자임-덱스트란 결합물의 유화성은 pH 3에서도 유지되었고 pH 10에서는 더욱 향상되었다. 이 결합물의 유화성은 100℃에서 5분간 가열하였을 때 유화성이 크게 향상되었다. 또 결합물의 유화성은 천연 라이소자임의 약 14배, 시판 유화제 보다는 약 3배정도 향상되었다.
라이소자임-덱스트란 결합물은 공시 그람 음성균 6균주, Pseudomonas fluorescens KCTC 1645, Serratia marcescens KCTC 1229, Shigella flexneri KCTC 2008, Salmonella typhimurium KCCM 11806, Proteus mirabilis KCCM 11381, Escherichia coli KCCM 11234에 항균 효과를 나타냈으며, 공시 그람 양성균 4균주중 Staphylococcus aureus 1225 KCCM을 제외한 Bacillus cereus KCCM 11714, Bacillus subtilis KCCM 11316, Micrococcus luteus KCCM 11211 3균주들에는 항균효과를 나타냈다. 이 결과들을 종합하여 볼 때 라이소자임-덱스트란 결합물은 저온살균 가공 유화식품 제조에 유화제나 보존료로 이용할 수 있을 것으로 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

To improve the emulsifying properties and the lytic activity of hen egg white lysozyme by binding it to dextran (a partial enzymatic hydrolysate of native dextran), lysozyme-dextran conjugate was prepared by Maillard reaction, and some emulsifying properties and lytic activity of the conjugate were investigated.
Lysozyme-dextran conjugate was prepared by mixing lysozyme and dextran with weight ratio of 1 to 2 under the condition of 80% relative humidity at 60℃ for 16days. To further purify lysozyme-dextran conjugate, gel filtration of the conjugate was performed on a column of Sephacryl S-300. Fraction numbers 67 to 145 were collected together, dialyzed for 48hrs at 4℃ . Thus the purified conjugate was freeze-dried for later use.
The conjugate of free amino groups in the lysozyme-dextran conjugate was identified by the trinitrobenzene sulfonate method. The binding ratio of free amino groups in the conjugate was 26.2%.
On the basis of the binding ratio, it was interpreted that 1 mole of lysozyme bound approximately to 2 moles of dextran.
Molecular weight of lysozyme-dextran conjugate was 45 kD by SDS-PAGE. When the conjugate was tested against Micrococcus lysodeikticus cell wall as substrate, optimum temperature and concentration for lytic activity were 50℃ and 0.4 mg/㎖, respectively. Km and k_(cat) were 8.16×10^(-6) M and 4.85×10^(-2) min^(-1), respectively, from Lineweavor-Burk plot. Thus k_(cat)/K_(M) was 5.93×10^(3) M^(-1) min^(-1).
The emulsifying activity of lysozyme-dextran conjugate at pH 3 was maintained as that at pH 7.4 and the activity at pH 10 was much higher. The activity was greatly increased when the conjugate was heated at 100℃ . Emulsifying activity of the conjugate was 14 and 3 times higher than native lysozyme and a commercial emulsifier, respectively.
Lysozyme-dextran conjugate was found to be antimicrobial against all 6 Gram negatives(Pseudomonas fluorescens KCTC 1645, Serratia marcescens KCTC 1229, Shigella flexneri KCTC 2008, Salmonella typhimurium KCCM 11806, Proteus mirabilis KCCM 11381, Escherichia coli KCCM 11234) tested and all 4 Gram positives (Bacillus cereus KCCM 11714, Bacillus subtilis KCCM 11316, Micrococcus luteus KCCM 11211, Staphylococcus aureus KCCM 12256) except Staphylococcus aureus KCCM 12256.
From the results mentioned above, it was concluded that lysozyme-dextran conjugate can be beneficially used in the manufacture of emulsified food products as a emulsifier and preservative.

목차 (Table of Contents)

• 국문요약 = ⅰ
• 목차 = ⅲ
• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 = 6
• 1. 재료 = 6
• 1-1 공시균주 및 배지 = 6
• 1-2 시약 = 6
• 2. 방법 = 7
• 2-1 라이소자임-텍스트란 결합물 조제 = 7
• 2-2 라이소자임-텍스트란 결합물 정제 = 7
• 2-3 라이소자임-덱스트란 결합물 유리 아미노기의 결합율 측정 = 9
• 2-4 라이소자임-덱스트란 결합물 분자량 = 9
• 2-5 라이소자임과 라이소자임-덱스트란 결합물의 활성 = 10
• 2-6 라이소자임과 라이소자임-덱스트란 결합물의 최적온도 = 11
• 2-7 라이소자임과 라이소자임-덱스트란 결합물의 유화성 = 14
• 2-8 라이소자임과 라이소자임-덱스트란 결합물의 용균성 = 14
• Ⅲ. 결과 및 고찰 = 16
• 1. 라이소자임-덱스트란 결합물 조제 및 정제 = 16
• 1-1 라이소자임-덱스트란 결합물 조제 = 16
• 1-2. 라이소자임-덱스트란 결합물 정제 = 17
• 2. 라이소자임-덱스트란 결합물의 유리아미노기 결합율 = 22
• 3. 라이소자임-덱스트란 결합물의 분자량 = 23
• 4. 라이소자임과 라이소자임-덱스트란 결합물의 효소활성 = 27
• 4-1 기질농도에 대한 라이소자임과 라이소자임-덱스트란 결합물의 반응속도 = 27
• 4-2. 라이소자임과 라이소자임-덱스트란 결합물의 효소 활성 최적온도 = 28
• 5. 라이소자임과 라이소자임-덱스트란 결합물의 유화성 = 34
• 5-1. 라이소자임, 라이소자임-덱스트란 결합물 및 덱스트란의 유화안정성 = 34
• 5-2. 라이소자임과 라이소자임-덱스트란 결합물의 열에 대한 유화안정성 = 34
• 5-3. 라이소자임과 라이소자임-덱스트란 결합물의 유화성의 pH영향 = 37
• 6. 라이소자임과 라이소자임-덱스트란 결합물의 용균성 = 42
• Ⅳ 결론 = 57
• 참고문헌 = 59
• Abstract = 70