Extremophile-Derived Cyclopropane Fatty Acid Synthase-Based Membrane Phospholipid Manipulation for Cell Robustness and Bioplastic Production Enhancement = 극한 미생물 사이클로프로페인 지방산 합성효소 이용 세포막 인지질 제어를 통한 균주 강인성 및 바이오플라스틱 생산 증대 연구

국문 초록 (Abstract)

미생물 세포막은 지질과 단백질로 구성되어 있으며 주변 환경과 미생물 세포질을 구분하며 외부의 여러 저해요소에 대한 직접적인 방어막으로써 작용하는 중요한 역할을 한다. 이러한 미생물 세포막은 온도, pH, 염도 등 다양한 환경 조건에 대응하여 항상성을 유지하기 위해 세부적인 구성 요소들의 종류 및 조성을 변화시키며 적응한다. 이러한 세포막의 변화를 보여주는 지표로써 세포막 무결성, 유동성, 투과성이 존재하며 지질, 단백질을 포함한 다양한 세포막 관련 요소에 대한 유전공학, 대사공학적 접근을 통해 변화시켜 다양한 환경요소에 대한 미생물의 내성을 증가시킬 수 있다. 이러한 이유에서 본 연구는 세포막 구성 요소 중 인지질을 구성하는 지방산에 주목하여 유전공학적 개량을 통한 지방산 조성 변화와 이로 인해 발생하는 세포막의 변화를 통한 미생물의 강인성 증대 가능성을 모색하기 위해 시작되었다. 그 과정에서 독특한 인지질 조성을 가진 미생물을 분리하기 위해 극한환경 유래 극한미생물에 대한 분리 및 선정과 유전공학적 접근을 통한 지방산 조성 변화, 각종 저해물질에 대한 미생물 강인성 증대와 이를 통한 폴리하이드록시알카노에이트 (Polyhydroxyalkanoate (PHA)) 생산 증대 과정을 제시하고 있다. 이러한 목표를 달성하기 위한 실험에서 극지 미생물 Pseudomonas sp. B14-6과 해양 미생물 Halomonas socia CKY01을 선별하였고 각각의 미생물에 대한 생장과 세포막 인지질 지방산 조성 변화를 확인하였으며, 온도와 염도로 대표되는 환경조건의 변화에서 주요 불포화지방산인 palmitoleic acid, elaidic acid와 cyclopropane fatty acids인 methylenehexadecanoic acid, methyleneoctadecanoic acid의 큰 변동을 확인할 수 있었다. 해당 변화와 각각의 균주에 대한 whole genome sequencing을 통해 관련된 생합성 유전자인 cyclopropane fatty acid synthase (cfa)의 서열을 성공적으로 확보할 수 있었다. 세 종류의 미생물 Escherichia coli, Pseudomonas sp. B14-6, H. socia CKY01로부터 각각의 유래 cfa를 대장균에 도입하여 생장을 확인하였을 때, H. socia CKY01 유래 cfa가 생장 측면에서 가장 효과가 좋다는 결론을 얻어 robustness 확인을 위한 저해실험 및 PHA 생산실험을 진행하였다. 그 결과 목질계 바이오매스 유래 생장 저해 물질들인 furfural, 4-hydroxybenzaldehyde, vanillin, acetate 존재 하에서 대조군 대비 각각 1.58배, 3.30배, 2.19배, 1.79배 상승한 생장을 보여 저해 물질에 대한 미생물의 강인성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이어진 PHA 생산을 위한 적용 실험에서 포도당을 탄소원으로 사용하였을 때 3.35 g/L의 건조중량 및 39.2 %의 PHA content로 대조군 대비 각각 1.43배 및 3.45배 증대된 생산을 보여주었으며 furfural, vanillin 등 저해물질이 포함된 목질계 바이오매스 유래 당을 탄소원으로 사용한 실험에서도 5.89 g/L의 건조중량과 47.4 %의 PHA content로 대조군 대비 1.42배의 생장과 2.14배의 PHA 생산량이라는 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 연구 결과들을 통해 극한 미생물 유래 지방산 합성 유전자의 도입을 통해 대장균 내 인지질 조성을 변화시킬 수 있음을 확인하였으며, 인지질 지방산의 변화로 인해 발생하는 세포막 변화로 인해 다양한 미생물 생장 저해 물질에 대한 저항성이 증대되는 것을 확인하고 증대된 미생물의 강인성으로 저해물질을 포함한 탄소원을 활용한 PHA 생산에 활용할 수 있다는 결과를 얻을 수 있었다. 지방산 합성 유전자 도입 시 지방산 조성의 변화, 생장의 변화, 생산량의 변화라는 형질에 관한 결과에 집중했다는 한계점이자 추가적인 연구가 가능한 부분이 존재하나, 생물공학적 물질 생산의 개선 및 미생물 강인성 증대의 가능성을 생리학적, 유전공학적 관점을 통해 수행해낸 연구라 할 수 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Extremophile-Derived Cyclopropane Fatty Acid Synthase-Based Membrane Phospholipid Manipulation for Cell Robustness and Bioplastic Production Enhancement Tae-Rim Choi Department of Biological Engineering Graduate School of Konkuk University Microbial cell membranes, composed of phospholipids and proteins, play a critical role in distinguishing the microbial cytoplasm from the external environment and act as a primary defense barrier against various inhibitory compounds and conditions. In response to diverse environmental conditions, such as type of microbes, temperature, pH, and salinity, microbial cell membranes adapt by altering the composition and types of specific characteristics to maintain membrane homeostasis. Membrane integrity, fluidity, and permeability serve as indicators of these adaptive changes, and genetic and metabolic engineering approaches targeting phospholipids, proteins, and other membrane-related elements can enhance microbial resistance to various environmental factors. In this context, the present study focuses on phospholipids, particularly the fatty acids that constitute them, aiming to explore the possibility of enhancing microbial robustness by modifying fatty acid composition through genetic engineering. This research includes the isolation and selection of extremophilic microorganisms from extreme environments with unique membrane lipid compositions and explores genetic modifications to alter fatty acid composition and enhance microbial resistance to various inhibitory compounds, ultimately improving polyhydroxyalkanoate (PHA) productivity. As a result, the polar microorganism Pseudomonas sp. B14-6 and marine microorganism Halomonas socia CKY01 were selected, and their growth and phospholipid fatty acid composition changes were examined. Significant fluctuations in major unsaturated fatty acids, such as palmitoleic acid and elaidic acid, as well as cyclopropane fatty acids like methylenehexadecanoic acid and methyleneoctadecanoic acid, were observed under varying environmental conditions represented by temperature and salinity. Through whole-genome sequencing, the gene sequence of cyclopropane fatty acid synthase (cfa), a key biosynthetic gene, was successfully obtained for each strain. When each of the cfa genes from Escherichia coli, Pseudomonas sp. B14-6, and H. socia CKY01 were introduced into E. coli, it was found that the cfa derived from H. socia CKY01 yielded the most favorable growth outcomes, leading to further inhibition tests and PHA production experiments to confirm enhanced robustness. In the presence of lignocellulosic biomass-derived growth inhibitors, such as furfural, 4-hydroxybenzaldehyde, vanillin, and acetate, the cfa overexpression strain had increased optical density at 595 nm by 1.58-fold, 3.30-fold, 2.19-fold, and 1.79-fold, respectively to control strain, confirming improved microbial resistance. Further application in PHA production using glucose as a carbon source achieved a dry weight of 3.35 g/L and a PHA content of 39.2 %, representing a 1.43-fold and 3.45-fold increase, respectively, over controls. When barley straw-derived sugar, containing inhibitors such as furfural and vanillin, was used as a carbon source, dry weight and PHA content were 5.89 g/L and 47.4 %, showing a 1.42-fold increase in growth and a 2.14-fold increase in PHA production relative to the control. These findings demonstrate that the introduction of fatty acid biosynthetic genes derived from extremophiles can alter cyclopropane fatty acid composition in E. coli, thereby enhancing microbial resistance to a variety of growth inhibitors through alterations in phospholipid fatty acid composition. Additionally, this enhanced robustness supports increased PHA production using biomass derived sugars containing inhibitory substances. While this study focused on phenotypic changes in fatty acid composition, growth, and productivity upon gene introduction, further research could expand on these findings. This work contributes to the field by providing insights into the enhancement of microbial robustness and bioproduction efficiency from physiological and genetic engineering perspectives.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 1
• 1.1. Bacterial membrane and membrane modulation for enhancing robustness 1
• 1.2. Cyclopropane fatty acid in phospholipid and bacterial robustness 9
• 1.3. Bacterial robustness and polyhydroxyalkanoates (PHA) production 12
• 1.4. Scope of thesis 15
• II. Materials and Methods 16
• 2.1. Bacterial strains and media, and culture conditions 16
• 2.1.1. Screening of microbe from the arctic soil 16
• 2.1.2. Construction of engineered Escherichia coli strains 16
• 2.1.3. Bacterial media and culture conditions 18
• 2.2. Phospholipid fatty acid (PLFA) analysis 23
• 2.3. Bacterial membrane characterization 24
• 2.3.1. Membrane hydrophobicity assay 24
• 2.3.2. Membrane fluidity assay 24
• 2.4. Whole-genome sequencing process 25
• 2.5. Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) 25
• 2.6. Bioplastic analytical method 26
• III. Results and Discussion 27
• 3.1. Selection of target bacteria and genes for phospholipid fatty acids modulation 27
• 3.1.1. The arctic soil bacterium Pseudomonas sp. B14-6 27
• 3.1.1.1. Screening of Pseudomonas sp. B14-6 from the arctic soil 27
• 3.1.1.2. Growth of Pseudomonas sp. B14-6 29
• 3.1.1.3. Membrane characterization of Pseudomonas sp. B14-6 31
• 3.1.1.4. PLFA analysis of Pseudomonas sp. B14-6 34
• 3.1.1.5. Whole genome sequencing of Pseudomonas sp. B14-6 37
• 3.1.1.6. Membrane-modulating gene search in Pseudomonas sp. B14-6 39
• 3.1.2. Marine bacterium Halomonas socia CKY01 41
• 3.1.2.1. Growth of Halomonas socia CKY01 41
• 3.1.2.2. PLFA analysis of Halomonas socia CKY01 43
• 3.1.2.3. Whole genome sequencing of Halomonas socia CKY01 46
• 3.1.2.4. Membrane-modulating gene search in Halomonas socia CKY01 48
• 3.1.2.5. qRT-PCR for cyclopropane fatty acid synthase (cfa) in H. socia CKY01 50
• 3.1.3. Summary 51
• 3.2. Enhancement of bacterial robustness by modulating bacterial phospholipid fatty acid composition 52
• 3.2.1. Overexpression of Δ9-desaturase (desA) derived from Pseudomonas sp. B14-6 in E. coli 52
• 3.2.1.1. desA effects on the growth of E. coli 52
• 3.2.1.2. Membrane characterization of E. coli that harboring desA 55
• 3.2.1.3. PLFA analysis of E. coli that harboring desA 58
• 3.2.2. Cyclopropane fatty acid synthase (cfa) overexpression in E. coli 62
• 3.2.2.1. Effects of various cyclopropane fatty acid synthase (cfa) on the growth of E. coli 62
• 3.2.2.2. Effects of various cfa on PLFA composition of E. coli 65
• 3.2.2.3. Growth of E. coli harboring cfa from H. socia CKY01 67
• 3.2.2.4. Membrane characterization of E. coli harboring cfa from Halomonas socia CKY01 71
• 3.2.2.5. PLFA analysis of E. coli harboring cfa from Halomonas socia CKY01 74
• 3.2.3. Robustness improvement in E. coli by introducing cfa from Halomonas socia CKY01 76
• 3.2.4. Enhancing robustness in E. coli for PHA production by introducing cfa from Halomonas socia CKY01 78
• 3.2.4.1. Production of PHA in engineered E. coli with glucose 78
• 3.2.4.2. Production of PHA in engineered E. coli with lignocellulosic biomass derived sugar 80
• 3.2.5. Summary 82
• IV. Conclusion 84
• Reference 86
• Abstract 96