심장비대 발생에 관여하는 Histone Deacetylase-2의 활성 조절 기전 = Activation Mechanism of Histone Deacetylase-2 in Development of Cardiac Hypertrophy

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cardiac hypertrophy is characterized by an enlargement of individual cardiomyocytes without apparent increase in the cell number. Although it could be a physiologic response, many clinical features such as myocardial infarction, hypertension, or valvular dysfunctions can cause pathologic hypertrophy. However, since few interventions to prevent cardiac hypertrophy are available yet, it is important to elucidate what molecule is a key factor to develop hypertrophy and how the molecule is regulated. This study was aimed to evaluate the regulation mechanism of histone deacetylase 2 (Hdac2), a class I HDAC, and to find the downstream target gene in various hypertrophy models.
Hdac2 increased the Nppa promoter, most commonly used as molecular markers of hypertrophy, activity. Cardiac hypertrophy, as determined by cell size or by stress fiber formation, was simulated by Hdac2. Heart lysates obtained from isoproterenol (ISP)-treated mice induced phosphorylation of recombinant GST-Hdac2 in vitro, which was completely blocked by treatment with apigenin, a casein kinase (CK) 2 inhibitor. CK2 was activated either in the hearts obtained from ISP-treated mice or in the cardiomyocyte challenged by phenylephrine. Phosphorylation-resistant Hdac2 mutant failed to induce the promoter activity of Nppa and Myh7. However, by immunoprecipitation assay it was observed that alteration of phosphorylation in response to hypertrophic stresses in endogenous Hdac2 was not significant, raising the possible involvement of alternate mechanism. Inducible heat shock protein, HSP70, physically interacted with Hdac2 in cell free systems. Both ATP-binding domain and C-terminal part of HSP70 was responsible for the interaction with Hdac2. The direct in vivo association between HSP70 and Hdac2 was confirmed by protein complementation methods as well as by confocal images. The activity of hexahistidine-tagged recombinant Hdac2 was further potentiated by adding GST-HSP70 in the presence of H9c2 lysates. HSP70ΔABD, a dominant negative HSP70, could not activate Hdac2. Interestingly, transfection of HSP70ΔABD significantly interfered the association between Hdac2 with wild type HSP70. HSP70 induced activation of Nppa promoter in cardiomyocyte, which was completely blocked by siHdac2. Forced expression of HSP70ΔABD blocked the activity of either Hdac2 or Nppa promoter. SK7041, a class I HDAC selective inhibitor, dose-dependently reduced Nppa promoter activity. Nppa promoter mapping study revealed that the region from -130 to -105 was essential for SK7041 action. By searching bioinformatics, KLF4 was predicted for candidate. KLF4 expression was increased in the treatment with SK7041 but downregulated by various hypertrophic stimuli. Transfection of KLF4 reduced either Nppa promoter activity or phenylephrine-triggered increase in the cell size.
In conclusion, these results implicate that HSP70/Hdac2/KLF4 might be targeted as novel molecules for preventing or treating heart disease with hypertrophy.

국문 초록 (Abstract)

심장비대는 심근 각 세포 수의 증가를 수반하지 않고 세포의 크기가 커진다는 특징이 있다. 이러한 심장비대는 생리적인 반응일 수도 있지만 일반적으로 심근경색, 고혈합 및 판막질환 등과 같은 임상 질환들에 의해 병적인 심장비대와 이에 따르는 심부전이 유발될 수 있다. 하지만 아직까지 적절한 치료방법이 없기 때문에 심장비대 발생 중에 가장 중요한 물질이 무엇이며, 이 물질이 어떻게 조절되는지를 밝히는 것은 매우 중요하다. 본 연구는 다양한 심장비대 모델에서 제 1종 히스톤 탈 아세틸화효소 (HDAC)인 히스톤 탈 아세틸화효소-2 (Hdac2)의 조절기전을 조사하고, 그 하위 표적 유전자를 찾고자 하였다.
Hdac2는 심장비대의 주요 발현 물질인 Nppa 프로모터 활성을 증가시켰으며, 과발현시킨 Hdac2는 세포의 크기를 증가시키고 스트레스 섬유 형성을 촉진하는 등 심장비대 표현형을 유발하였다. 동물실험에서, isoproterenol (ISP)을 처리하여 얻은 생쥐 심장 단백질은 재조합 GST-Hdac2 단백질의 인산화를 증가시켰으며, 이러한 인산화 증가 현상은 CK2 억제제인 apigenin을 처리하였을 때 완벽히 차단되었다. ISP 처리한 생쥐 심장과 phenylephrine (PE) 자극을 준 심근세포 모두에서 CK2 활성이 증가되어 있었다. 인산화 저항성 변형 Hdac2 (mutant Hdac2)는 Nppa 와 Myh7 프로모터 활성을 증가시키지 못하였다. 하지만 면역침강 실험에 의하면, 심장비대 자극에 의한 세포 내 내재성 Hdac2의 인산화 변동은 유의적이지 않았고 이는 다른 조절 기전이 존재할 가능성을 시사하였다. 유도성 heat shock 단백인 HSP70은 Hdac2와 직접 결합하였으며 이러한 상호작용은 ATP-결합부위 (ABD) 와 카르복실단말의 일부분, 두 곳에서 매개되었다. 세포 내 상호작용은 조각 단백질 재완성 방법과 confocal 현미경을 통해 재확인되었다. 재조합 His-Hdac2는 세포 성분이 있을 때 고유 활성을 나타내었고, 이 활성도는 GST-HSP70를 첨가하였을 때 더욱 증가되었다. HSP70의 dominant negative (dn) 형인 HSP70 ABD는 Hdac2을 활성화시키지 못했으며, 정상 HSP70과 Hdac2의 결합을 방해하였다. HSP70은 심근세포에서 Nppa 프로모터 활성을 증가시켰으나 이러한 현상은 siHdac2에 의해 차단 되었다. 과발현 된 HSP70 ABD는 정상 HSP70에 의해 증가된 Hdac2 활성도와 Nppa 프로모터 활성 모두를 차단하였다. 새로운 제 1종 HDAC 억제제인 SK7041은 농도 의존적으로 Nppa 프로모터 활성을 감소시켰다. Nppa promoter mapping 연구에 의하면 전사 시작 부위보다 상위로 존재하는 -130부터 -105 부분이 SK7041 작용에 중요함이 밝혀졌고 생물정보학기법으로 이 곳에 결합하는 인자로 KLF4가 후보로 결정되었다. KLF4의 발현은 SK7041 투여로 증가되었고 다양한 심장비대 자극으로 인해 감소되었다. KLF4의 과발현 실험에서 Nppa 프로모터 활성이 감소함을 확인하였고, PE에 의해 증가되는 세포 크기를 유의적으로 감소시켰다.
결론적으로 이러한 결과들은 HSP70/Hdac2/KLF4 신호 전달 체계가 심장비대를 포함하는 심장 질환을 치료하고 예방하는 물질을 개발하는데 고유한 표적이 될 수 있음을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• (Abstract) = 1
• INTRODUCTION = 3
• MATERIALS AND METHODS = 8
• RESULTS = 19
• DISCUSSION = 47
• REFERENCES = 54
• (국문초록) = 64