대식세포와 암세포에서 decursin과 decursinol angelate에 의한 염증매개물질의 저해 : Decursin and decursinol angelate inhibit induction of inflammatory mediators in macrophages and cancer cells

국문 초록 (Abstract)

Matrix metalloproteinases (MMPs)의 발현은 대식세포에 의한 염증 반응과 암세포의 invasion과 metastasis를 나타나는 여러 징후 가운데 하나로 extracellular matrix (ECM)를 손상시키는 중요한 요소이다.
당귀로부터 추출한 decursin과 decursinol angelate가 대식세포와 종양세포 각각에서 염증매개물질의 유도를 저해시키는가를 알아보았다.Decursin의 활성을 확인하기 위하여 쥐 및 사람의 대식세포주인 RAW 264.7 세포와 THP-1 세포를 사용하였다. 각 세포에 decursin을 농도 (20~60 μM)별로 2시간 전 처리하고, 세균성 내독소인 lipopolysaccharide (LPS; 0.1 or 1 μg/ml)로 세포를 활성화 시켜 MMP-9의 발현 저해 활성을 gelatin zymogram으로 측정하였다. 그 결과 처리한 가장 낮은 decursin의 농도(20 μM)에서부터 농도 의존적으로 MMP-9의 발현이 억제됨을 확인하였다. 이러한 decursin의 활성은 세포의 생장에는 아무런 영향을 미치지 않음을 MTT assay를 통해 확인하였다. TLR의 여러 ligand와 IL-1β, TNF-α의 자극으로 발현되는 MMP-9도 처리한 decursin의 농도 의존적으로 저해됨을 확인할 수 있었다. 또한 decusin이 LPS에 의해 유도된 염증반응에 관여하는 여러 cytokine (IL-8, MCP-1, IL-1β, TNF-α)의 발현을 control과 유사 수준으로 급격히 저해시킴을 확인하였다. MMP-9과 여러 cytokine의 저해가 일어나는 것은 decursin이 신호전달체계에서 IκB의 인산화를 막고, NF-κB가 활성화되어 핵 속으로 이동하는 것을 막기 때문임을 알게 되었다. 당귀에서 추출한 또 다른 물질인 decursinol angelate의 활성을 여러 종양세포에서 살펴보았다. 세포에 TNF-α (50 ng/ml)로 자극을 주고 decursinol angelate를 농도 별로 처리하여 MMP-9의 발현을 측정한 결과 처리한 decursinol angelate의 농도 의존적으로 MMP-9의 발현이 저해됨을 확인할 수 있었다. Decursinol angelate의 활성과 세포 생장은 종양세포의 종류에 따라 다소 차이를 나타냈으며, 암세포와 관련한 cytokine의 발현 또한 cytokine의 종류에 따라 특이적으로 발현을 저해시킴을 확인할 수 있었다.
이상의 결과를 통해, coumarin계 유도체인 decursin과decursinol angelate가 대식세포와 암세포에서 염증매개물질의 유도를 저해시키는데 효과적임을 확인할 수 있었다.
나아가 이물질들의 작용이 어떠한 신호전달체계에 관여하는지 좀 더 깊이 연구 할 필요가 있으며, 염증과 관련한 여러 질병모델에서도 효과적으로 작용하는지 살펴볼 필요가 있음을 밝혔다.

목차 (Table of Contents)

• I . Introduction = 1
• 1. Toll-like receptor = 1
• 2. Toll-like receptor: Structural characteristics and their ligands = 2
• 3. Toll-like receptor signaling = 4
• 4. Cancer and MMP-9 = 5
• 5. Decursin and decursinol angelate = 6
• 6. Purpose of study = 7
• Ⅱ. Materials and Methods = 9
• 1. Reagents and antibodies = 9
• 2. Cell culture and activation = 9
• 3. Gelatin zymogram = 11
• 4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) = 12
• 5. Western blotting = 13
• 6. Cell viability test (MTT Assay) = 14
• 7. Immunofluorescence assay = 15
• 8. Real time RT-PCR = 16
• 9. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR) = 17
• Ⅲ. Results = 19
• 1. Decursin blocks MMP-9 expression in RAW 264.7 cells stimulated with LPS without affecting cell viability = 19
• 2. Decursin blocks induction of MMP-9 in monocytic cells lines stimulated with various agents and in primary macrophage stimulated with LPS = 19
• 3. Decursin blocks cytokine expression induced by LPS in monocytic cell line = 23
• 4. Decursin suppresses MMP-9 expression at transcription level = 25
• 5. Decursin blocks activation of NF-κB = 27
• 6. Decursin blocks phosphorylation and degradation of IκB = 27
• 7. Decursinol angelate inhibits TNF-α-stimulated MMP-9 upregulation in cancer cells without affecting cell viability = 31
• 8. Decursinol angrelate spicifically inhibits IL-8, but not IL-6 expression induced by TNF-α in HT1080 cells = 32
• 9. Decursinol angelat suppresses MMP-9 expression at the transcription level = 39
• Ⅳ. Discussion = 43
• Ⅴ. Summary = 46
• Ⅵ. References = 48
• 초록 = 52