환경 미생물의 실시간 현장 비색 검출을 위한 미세유체 칩 = A fabricated microfluidic analytical device for real-time in situ colorimetric detection of microorganisms in environmental samples

국문 초록 (Abstract)

환경매질의 미생물 오염으로 인한 문제가 심각하여 이를 사전에 방지하기 위한 방안이 필요하다. 그러나 미생물 검사를 위한 기존의 공정시험법 및 관련 기술들은 복잡하고 고가의 장비가 수반되며 시료의 운반 및 분석까지 장시간이 요구되는 단점이 있다.
따라서, 본 연구는 미세유체 칩(Microfluidic analytical device)을 통하여 실시간으로 현장에서 즉시 사용할 수 있는 저비용 미생물 오염 측정 및 분석 장치를 구현해 내는 것을 연구목표로 하였다.
실험실상의 미생물의 시험을 위한 미생물은 Escherichia coli(E.coli, XL-Blue strain)를 사용하였다. 배양된 E.coli 의 현탁액을 멸균 생리식염수로 희석하여 서로 다른 5가지 개체수로 나누었으며 이는 각각 Group 1; 0 cells/mL, Group 2; 5.60 ×106 cells/mL, Group 3; 1.74×108 cells/mL, Group 4; 3.70×108 cells/mL, 및 Group 5; 8.77×108 cells/mL 이었다.
현장에서 육안으로 미생물을 검사하기 위한 비색검출 방법으로 펜톤반응(Fenton’s reaction)을 적용시킨 변형된 카탈라제(Catalase, EC 1.11.1.6) 효소기질 반응을 선정하였다.
미생물을 검출하는 칩으로는 종이기반 미세유체 칩(paper based microfluidic analytical device, μPAD)을 제작하였으며 이는 왁스 프린팅 기법(wax printing method)을 통하여 7초간 100℃에서 처리하는 조건이었다.
제작한 μPAD를 이용하여 0~8.77×108 cells/mL 범위의 E.coli 시료 각각에 대하여 미생물 비색 검출을 수행하였다. 실험 결과 생성된 μPAD의 검출부(detection chamber)의 비색 분석은 색상(hue, H), 채도(saturation, S), 및 명도(value, V)를 뜻하는 HSV 색공간(color space)을 기반으로 300 픽셀(pixels)의 정밀도로 분석되었다. 그 결과 각 시료에 대응하는 검출부의 색의 강도는 미생물 시료의 개체수가 Group 1; 0 cells/mL에서 Group 5; 8.77×108 cells/mL로 갈수록 색상(H)은 13˚에서 35˚로 증가, 채도(S)는 51.4 % 에서 19.0 %로 감소, 그리고 명도(V)는 70.2 %에서 92.9 %로 증가하는 경향성을 확인할 수 있었다.
또한 여러 가지 환경 시료의 비색 검출을 실시하였다. 환경 시료는 수질시료(먹는 샘물, 음용수(정수기물), 가습기 물, 및 수조수)와 토양시료(일반 표토, 농토, 및 축산비료 부유토)을 채취하여 시험하였다. 그 결과 채취한 환경시료의 미생물 개체수 범위는 E.coli 시료를 이용하여 얻은 미생물 색도 기준표(colorimetric reference chart) 범위 내에 포함되었으며 이러한 환경시료의 분석 결과 또한 색도 분석에 있어 유의한 상관관계(r = 0.91, 0.95, 및 -0.84)가 있을 확인하였다. 이는 위에 제시된 미생물의 개체수 범위 내에서 육안으로 비색 검출 판독을 확인할 수 있는 결과이며 10회 반복시험 결과의 재연성(reproducibility)을 통계적으로 검증하였다. 그 결과 색상(H) 및 채도(S) 의 평균값 ± 표준편차 값은 각각 23.00±1.23, 42.10±3.51로 유의성(P < 0.05, n = 10)있게 재연성이 확인되었으며 명도(V)는 82.00±3.80으로 통계적인 유의성(P < 0.01, n = 10)있게 재연성이 있는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서 개발한 μPAD는 환경시료의 미생물 개체수를 비색반응을 통하여 육안으로 판독하였으며, 기타 분석장비 없이 수행함으로써 현장에서 실시간 검출의 성능이 있는 것으로 확인되었다.

목차 (Table of Contents)

• 국 문 초 록
• Ⅰ. 서 론 1
• 1. 연구배경 및 필요성 1
• 1-1. 환경 매개성 질병과 미생물 영향 1
• 1-2. 미생물의 관리기준 및 시험법 5
• 2. 국내외 동향 8
• 2-1. 미생물 시험방법 및 연구 현황 8
• 2-2. 바이오칩(biochip)을 이용한 미생물 검출기술 및 연구 동향... 9
• 2-3. 검출대상 환경 미생물 특성 11
• 3. 연구목적 12
• Ⅱ. 실험재료 및 방법 13
• 1. 미생물 13
• 1-1. 미생물 배양 13
• 1-2. 환경 미생물 시료의 채취 및 준비 14
• 2. 미생물 검출용 비색반응 개발 및 선정 15
• 3. μPAD 제작, 미생물 검출 범위 확인 및 색도 분석 16
• 4. μPAD를 이용한 환경 미생물 오염도 측정 및 색 분석 18
• 5. 통계 분석법 18
• Ⅲ. 실험 결과 20
• 1. 미생물 검출용 비색반응 비교분석 20
• 2. μPAD의 성능평가 22
• 2-1. μPAD 유체 채널 성능평가 22
• 2-2. 최적 발색 반응을 위한 기질 농도 확인 24
• 2-3. 검출 가능 미생물 개체수 및 색 분석 26
• 2-4. μPAD의 재연성 분석 28
• 3. μPAD를 이용한 환경 미생물 검출 적용평가 29
• Ⅳ. 고 찰 32
• Ⅴ. 결 론 38
• Ⅵ. 참고 문헌 41
• Abstract
• 감사의 글