에틸렌에 의한 Arabidopsis thaliana의 뿌리털 형성 시 발현되는 유전자에 관한 연구 = (A) gene expression and proteomic analysis about root hair formation which is positively regulated by ethylene in Arabidopsis seedling

국문 초록 (Abstract)

식물은 뿌리에서의 물, 양분의 흡수를 효율적으로 하기 위해 뿌리털 즉, root hair라는 특이한 표피세포를 발달, 분화시킨다. plant model 중 널리 이용되는 Arabidopsis의 root를 관찰해 보면 그 표피세포가 두 가지 types 즉 root hair cells 과 non hair cells로 나누어지는 것을 볼 수 있다. 이러한 뿌리털의 형성 및 발달 과정에는 식물 호르몬이 관여하는 것으로 알려져 왔는데 gas 형태의 plant hormone인 ethylene은 노화와 stress에 관련된 hormone으로 알려져 있을 뿐 아니라 root hair development의 positive regulator로 확인된 바 있다. 에틸렌에 의한 신호전달이 차단된 돌연변이체에선 뿌리털의 발달이 거의 일어나지 않으나 에틸렌에 의한 신호전달이 에틸렌의 유, 무와는 관계없이 지속되는 돌연변이에서는 ectopic root hair 형성이 일어남은 오래전에 알려진바 있으며 또한 ethylene 전구체인 ACC를 처리한 Arabidopsis 에서는 ectopic root hair 형성이 일어나는 반면 ethylene 형성 inhibitor인 AOA를 처리하면서 키운 Arabidopsis seedling에서는 root hair가 관찰되지 않은 점을 통해 에틸렌이 뿌리털 형성의 positive regulator임을 확인할 수 있었다.
본 실험자는 뿌리털 형성 시 발현양이 증가하거나 단백질의 합성양이 증가하게 되는 유전자를 분리함으로써 직접적으로 뿌리털의 형성에 관여하는 유전자들을 확인하고자 두 가지 실험을 수행하였다. subtractive hybridization 실험을 통해 Arabidopsis의 에틸렌 관련 돌연변이인 ein2 와 ctr1의 유전자 발현 양상을 비교하여 ctr1에서 뿌리털 형성이 과도하게 일어날 때 발현양이 증가되는 유전자들을 분리하였으며 그들의 sequence를 분석하여 발현이 증가되는 유전자의 종류를 확인할 수 있었다. 주로 세포벽의 확장이나 세포의 길이 생장 등에 관여하는 유전자들, 에틸렌에 의해 나타나는 외부 스트레스에 대한 방어체계에 관여하는 유전자들, 그리고 아직까지 그 기능이 증명되지 않은 몇 가지의 유전자들이 분리된 것을 알 수 있었다. 이들 중 일부 유전자에 대해 뿌리털 형성과 어떠한 연관성이 존재하는지를 구체적으로 연구해 나갈 계획이다.
두 번째로 에틸렌 합성 억제제인 AOA를 전처리하여 뿌리털의 형성이 억제되어있는 Arabidopsis에 에틸렌 전구체인 ACC를 가하여 뿌리털 형성을 유도한 후 그들의 protein 발현 양상의 변화를 2-dimentional electrophoresis를 수행하여 추적하였고 변화된 protein 의 amino acid sequence를 확인하여 유전자의 종류를 확인할 수 있었다. 특히 AOA 처리구에서 발현양이 매우 미미하여 측정이 어렵지만 ACC 처리 후 단백질의 발현양이 크게 증가하는 유전자로 GST gene family 중의 하나인 AtGSTF2 유전자를 확인할 수 있었다. 이들의 유전자 발현 양상을 RNA level 에서 조사해 본 결과 2-DE 결과에서 발현양의 변화가 나타나지 않던 AtGSTF8 이나 AtGSTU19 gene과는 대조적으로 ACC 처리 후 뿌리털 형성이 나타나는 시점 까지 그 발현양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. AtGSTF2가 애기장대 유묘의 뿌리에서 특이적으로 에틸렌에 민감하게 반응함으로써 어떠한 기능을 할지는 아직 정확히 규명하기 힘들지만 몇 가지 가능성과 함께 앞으로 뿌리털 형성 시 AtGSTF2의 기능에 대한 연관성에 대해 좀더 깊은 연구가 수행되어야 하겠다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The plant hormone ethylene has been shown to play an important role in root hair development in Arabidopsis.
To select many genes that are involved in root hair formation by ethylene, we performed subtractive hybridization using ctr1 and ein2 mutant. The ctr1 mutant showed up ectopic root hair formation but the ein2 mutant had very few root hairs. So, by using subtractive hybridization, we identified twenty three distinct genes which expression are induced in ctr1 mutant but decreased in ein2 mutant.
With the aid of proteomic analysis, we identified three distinct glutathione S-transferase (GST) isoforms, AtGSTF2, AtGSTF8, and AtGSTU19, expressed early inroot epidermal establishment in Arabidopsis seedlings. The AtGSTF2 protein was specifically up-regulated by ethylene. A subsequent RNA expression study revealed that the AtGSTF2 gene was highly sensitive to ethylene, whereas the transcripts for AtGSTF8 and AtGSTU19 were constitutively present in new root tissue of 4-day-old seedlings. The steady-state level of AtGSTF2 mRNA was greatly reduced in the roots of ethylene-insensitive mutants, while mutation at the CTR1 locus, which confers an ectopic root hair phenotype, resulted in a markedly elevated level of AtGSTF2 transcript in young root tissue. Although the physiological function of ethylene-induced AtGSTF2 is not yet clear, there are several possibilities for its role during early root development.

목차 (Table of Contents)

• 차례 = ⅰ
• 그림 차례 = ⅲ
• 표 차례 = ⅳ
• 국문요약 = ⅴ
• 제1장. 서론 = 1
• 제2장. 실험 재료 및 방법 = 4
• 2.1. 실험재료 = 4
• 2.1.1 Arabidopsis thariana (애기장대) = 4
• 2.1.2 AOA와 ACC 처리 방법 = 4
• 2.2. 실험방법 = 4
• 2.2.1 Total RNA extraction = 4
• 2.2.2 Poly(A) RNA 분리 = 5
• 2.2.3 Subtractive Hybridization = 5
• 2.2.4 Dot Blotting = 5
• 2.2.5 Reverse Northern blot analysis = 6
• 2.2.6 Radioactive labeled probe의 제조 = 6
• 2.2.7 Northern blot analysis = 6
• 2.2.8 Protein extraction and 2-dimensional electrophoresis analysis = 7
• 2.2.9 Tryptic digestion and protein identification by MALDI-TOF-MS = 7
• 2.2.10 RNA isolation, RT-PCR, and Northern analysis = 8
• 제3장. 실험결과 = 9
• 3.1. Gene expression analysis = 9
• 3.1.1 에틸렌 신호전달 관련 돌연변이체의 뿌리 표현형질 = 9
• 3.1.2 subtractive hybridization = 9
• 3.1.3 Subtracted cDNA library의 제작 = 9
• 3.1.4 Differential screening of the subtracted library = 12
• 3.1.5 Northern blot analysis = 12
• 3.1.6 sequencing 분석 결과 = 16
• 3.2. Proteomic analysis = 21
• 3.2.1 AOA와 ACC에 의해 나타나는 뿌리털 형성 억제와 유도 = 21
• 3.2.2 2-dimensional electrophoresis 결과 = 21
• 3.2.3 ACC-treated young roots에서 확인된 3개의 GST isoforms = 24
• 3.2.4 어린 뿌리조직에서 에틸렌에 의한 다른 반응성을 나타내는 GST gene family = 27
• 3.2.5 다양한 에틸렌 신호전달 관련 돌연변이체에서 AtGSTF2의 발현 양상 = 27
• 제4장. 고찰 = 31
• 제5장. 결론 = 33
• 제6장. 참고문헌 = 35
• Abstract = 40