Transcriptome-wide analysis of poly(A) tail and RNA-protein interaction

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

RNAs store and transfer information among constituents of the cell. From their biogenesis to processing, transport, translation, catalysis, and decay, many cellular factors are involved to achieve tight regulation. Following the development of high-throughput DNA sequencing, it has become an essential tool to scrutinize RNA molecules in the cell in unprecedented scale and depth. This thesis concerns methodological advances in two aspects of RNA regulation. First, I develop a novel method to survey global status of polyadenylation that takes a fundamentally different approach from the existing techniques. Despite its importance in gene regulation, global investigation of the 3′ extremity of mRNA has not been feasible due to technical challenges associated with homopolymeric sequences and relative paucity of mRNA. The new technique, named as TAIL-seq, allows measuring poly(A) tail length at the genomic scale for the first time. I also discover widespread uridylation and guanylation at the downstream of poly(A) tail. The U-tails are generally attached to short poly(A) tails (<25 nt) while the G-tails are found mainly on longer poly(A) tails (>40 nt), implicating their generic roles in mRNA stability control. Furthermore, TAIL-seq identifies, with a single nucleotide resolution, numerous nucleolytic events involved in microRNA processing and mRNA cleavage. TAIL-seq will enable exploration of unforeseen diversity of RNA processing and modification.
Secondly, I describe an array of new analytic methods to crosslinking, immunoprecipitation, and sequencing (CLIP-seq) to enhance its utility in the investigation of RNA-protein interactions. CLIP-seq arose as one of the standard techniques to retrieve transcriptome-wide information of RNA-protein interactions in last few years. However, generalized analysis techniques and tools have been missing unlike the other RNA-seq applications. In this study, I generalize analytic workflow for binding site identification by developing new methods. I also provide an open source toolchain that covers most of the common analyses performed for CLIP-seq. In addition, I present ecliptic, a fully automated pipeline, and it will speed up the research of RNA-protein interactions and make more information accessible to researchers.
High-throughput experiments are expanding biology by providing unbiased view and leading to unexpected observations. In this thesis, I introduce two types of development for global investigation of poly(A) tails and single nucleotide resolution survey of RNA-protein interactions. By applying these methods, I discover several phenomena at the 3′ end of RNAs and the binding interfaces between RNA and RBPs. Further development and improvement will offer an ample opportunity for the discovery of unforeseen regulatory pathways.

국문 초록 (Abstract)

리보핵산(RNA)은 정보를 저장하고 세포 구성 물질 간에 정보를 전달하는 매개 물질이다. RNA의 생성부터 처리, 운반, 단백질 번역, 촉매 작용, 분해까지 세포 안의 많은 구성요소들이 정해진 생리적 현상을 일으키기 위해 RNA을 정확히 조절한다. 대용량 디옥시리보핵산(DNA) 서열분석 기술의 개발에 따라, RNA 조절 분야의 연구자들은 빠르게 이 기술을 받아들여 기존에 없었던 정밀도로 세포 안의 RNA를 관찰하기 시작했다. 이제 해당 분야의 획기적 발견들은 대부분 대용량 서열분석에 강하게 의존하고 있다. PIWI-상호작용 RNA, 단백질을 만들지 않는 긴 RNA (lincRNA), lincRNA의 주요 작용 메커니즘, 기존 경로와 다른 마이크로RNA의 신생성 과정, RNA 접합 조절 등이 모두 대용량 서열분석을 이용한 새로운 발견이다.
이 논문에서 나는 두 가지 종류의 RNA 조절을 연구하는데 사용될 기술을 새롭게 개발하고 그를 응용한다. 첫 번째로, 세포 전체의 아데닐산중합반응 상태를 조사할 수 있는 새로운 방법을 개발했다. 전령RNA의 3′ 말단은 유전자 발현 조절에서 아주 중요하지만, 단독중합체는 서열을 해독하기 매우 어렵기 때문에 전사체 수준에서 분석할 수 없었다. TAIL-seq이라고 명명된 기술을 개발하여, 폴리아데닐산 꼬리 길이를 유전체 전체에서 최초로 잴 수 있었다. 또한, 나는 폴리아데닐산 꼬리 뒷 부분에 유리딘화와 구아닌화가 광범위하게 일어난다는 사실을 발견하였다. 유리딘 꼬리는 보통 25 nt 미만의 짧은 폴리아데닐산 꼬리 뒤에서 관찰되었고, 구아닌 꼬리는 40 nt 이상의 긴 폴리아데닐산 꼬리 뒤에서 주로 발견되었다. 이는 유리딘과 구아닌 꼬리가 전령RNA의 안정성 조절에 관련이 있을 수 있음을 시사한다. 그리고, TAIL-seq 분석 결과 마이크로RNA와 전령RNA의 가공과 분해에 관련된 많은 종류의 핵산 분해 현상이 단일 염기 단위 해상도로 관찰되었다. 따라서, TAIL-seq을 이용하여 RNA 가공과 수식에 관련된 예측하지 못한 현상들을 살펴볼 수 있을 것이다.
두 번째로 나는 자외선 교차결합, 면역침강 후 서열분석법(CLIP-seq)을 개선함으로써 RNA와 단백질의 상호작용을 분석하는데 유용하게 사용할 수 있는 방법들을 개발하였다. CLIP-seq은 RNA와 단백질 상호작용 정보를 전사체 범위로 연구하는 데 있어 필수적인 도구 중의 하나로 떠올랐다. 그러나, 아직 다른 RNA 서열분석법들과 달리 일반화된 방법론과 도구가 정립되지 않았다. 이 연구를 통해 새로 개발된 통계적, 시각적 분석 방법들은 예전에 쉽게 관찰할 수 없었던 새로운 정보를 드러낼 수 있을 것이다. 추가로, 새로이 개발된 CLIP 분석 도구 모음인 ecliptic은 RNA와 단백질 상호작용 연구를 더 빠르게 할 것이며 연구자들이 더 많은 정보에 접근하기 쉽도록 만들 것이다.
이 논문에서는 폴리아데닐산 꼬리의 전체적인 연구와 RNA 단백질 간 상호작용의 특정성에 대한 단일 염기 단위 해상도 조사법에 대해 기술적인 개선을 이루었다. 이로써, RNA의 3′ 말단과 RNA와 RNA 결합 단백질 사이의 인터페이스에 대한 여러 현상들을 발견했다. 대용량 실험 기법들은 편향되지 않은 시각을 제공하고 기존 방법으로 알기 어려웠던 현상을 관찰할 수 있게하여 생물학의 범위를 확장시키고 있다. 기존 기술들의 유연한 변용을 통해서 새로운 발견의 기회가 더욱 늘어날 것으로 보인다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract - i
• Contents - iii
• List of Figures - vi
• List of Tables - x
• List of Algorithms - xi
• List of Abbreviations - xii
• 1. Introduction
• 1.1 Post-transcriptional regulation of eukaryotic gene expression - 1
• 1.2 High-throughput methods in RNA biology - 2
• 1.2.1 Transcriptome profiling - 3
• 1.2.2 RNA-protein interactome analysis - 7
• 1.2.3 Monitoring transcriptome-wide polyadenylation status - 9
• 1.2.4 Analysis of RNA ends - 10
• 2. Transcriptome-wide profiling of 3′ ends of poly(A)+ RNAs
• 2.1 Background - 13
• 2.2 Technical difficulties of sequencing poly(A) tails - 14
• 2.2.1 Problems in high-throughput sequencing for long homopolymers - 14
• 2.2.2 Design of library construction - 15
• 2.3 Sequence data processing and acquisition - 19
• 2.3.1 Data acquisition and processing - 19
• 2.3.2 Sequence processing and alignment - 22
• 2.3.3 Sequence annotation and classification - 23
• 2.4 Processing fluorescence signals for sequencing poly(A) tails - 24
• 2.5 Machine learning for detection of poly(A) tail lengths - 27
• 2.5.1 Homogeneous sampling for training set - 29
• 2.5.2 Methods for poly(A) length measurement - 29
• 2.5.3 Combination of measurement and base calls - 39
• 2.6 Poly(A) tails of the mammalian transcriptome - 39
• 2.6.1 Steady-state length distribution of poly(A) tails - 41
• 2.6.2 Impact of poly(A) tails on gene expression - 46
• 2.7 Analysis of 3′ end modification of poly(A) tails - 51
• 2.7.1 Method for detection and filtering terminal modifications - 52
• 2.7.2 3′ Terminal uridylation of poly(A) tails - 52
• 2.7.3 3′ Terminal gualylation of poly(A) tails - 54
• 2.8 Detection of cleavage and polyadenylation sites - 57
• 2.8.1 Method for polyadenylation site detection - 57
• 2.8.2 Differential poly(A) tail lengths for alternative polyadenylation sites - 58
• 2.9 Detection of RNA 3′ hydroxyl ends - 60
• 2.9.1 Methods for 3′ end detection - 60
• 2.9.2 Comparison to the known 3′ ends in transcriptome - 61
• 2.9.3 Newly discovered 3′ ends - 63
• 2.10 Discussion - 65
• 3. Analysis of RNA-protein interactions by high-throughput sequencing
• 3.1 Background - 67
• 3.2 Reference data preparation - 69
• 3.2.1 Sequence processing and alignment - 69
• 3.2.2 Sequence annotation and classification - 72
• 3.3 Binding site detection - 73
• 3.3.1 Metrics for crosslinking-induced errors - 73
• 3.3.2 Error characteristics of different RNA-binding proteins - 74
• 3.3.3 Statistical analysis of crosslinking-induced errors - 77
• 3.4 Recognition motif analysis of binding sites - 84
• 3.4.1 Sequence motif analysis of binding sites - 84
• 3.4.2 Secondary structure motif analysis of binding sites - 86
• 3.5 Fully automated pipeline for CLIP-seq analysis - 86
• 3.6 Discussion - 93
• 4. Conclusion - 95
• Summary (in Korean) - 97
• Bibliography - 99
• Index - 119