Proteomic analysis for biomarker discovery in autism spectrum disorder using mass spectrometry : Mass spectrometry based proteomics

국문 초록 (Abstract)

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 광범위한 행동 및 인지적 증상을 특징으로 하는 복잡한 신경발달 질환으로, 조기 진단에 상당한 어려움을 겪습니다. 따라서 신뢰할 수 있는 바이오마커를 식별하는 것은 조기 발견 및 개입 전략을 개선하는 데 필수적입니다. ASD 연구의 최근 진전에도 불구하고 일관된 생물학적 마커의 부재는 여전히 중요한 한계로 남아 있으며, 강력한 바이오마커 발견의 필요성을 강조합니다. 이 연구는 질량 분석 기반 프로테오믹 분석을 통해 ASD에 대한 잠재적 바이오마커를 식별하고 검증하여 장애와 관련된 분자 패턴을 발견하고 근본적인 생물학적 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다. 자폐 스펙트럼 장애에 대한 바이오마커를 식별하는 것은 조기 진단, 개인화된 치료 및 장애의 근본적인 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다. 바이오마커는 생물학적 과정에 대한 객관적이고 정량화된 지표로, 자폐 스펙트럼 내에서 다양한 표현을 감안할 때 매우 중요한 다른 신경발달 장애와 ASD를 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 현재 ASD 진단은 주로 행동 평가에 의존하며, 이로 인해 진단 및 개입이 지연될 수 있습니다. 유전적, 신경 영상 또는 생화학적 마커와 같은 바이오마커는 더 빠르고 정확한 진단과 시간 경과에 따른 ASD 관련 신경 생물학적 변화를 추적할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 신뢰할 수 있는 바이오마커를 식별하면 특정 생물학적 경로를 임상 증상과 연결하여 표적 치료 전략의 개발을 용이하게 할 수 있으며, 궁극적으로 ASD가 있는 개인의 결과와 삶의 질을 개선하는 데 기여할 수 있습니다. 혈장에서 고농도 단백질을 고갈시키는 것은 자폐 스펙트럼 장애의 바이오마커를 식별하는 데 중요한 단계입니다. 혈장은 잠재적 바이오마커의 풍부한 공급원이지만 광범위한 단백질 농도를 포함하고 있으며, 소수의 고농도 단백질(예: 알부민, 면역글로불린)이 총 단백질 함량의 90% 이상을 차지합니다. 이러한 우세한 단백질은 ASD 병리 생리학과 관련이 있을 수 있는 단백질을 포함하여 저농도 단백질의 존재를 가릴 수 있어 탐지가 어렵습니다. 고갈 기술을 사용하면 이러한 고농도 단백질을 줄이거나 제거할 수 있으므로 유익한 바이오마커 역할을 할 수 있는 저농도 단백질에 대한 혈장을 풍부하게 할 수 있습니다. 하류 분석 기법(예: 질량 분석법)의 민감도를 향상시킴으로써 고갈은 ASD와 관련된 새롭고 미묘한 분자적 시그니처의 발견을 용이하게 하여 진단 및 치료 전략을 개선할 수 있습니다. 이 논문의 첫 번째 목표는 건강한 개인과 자폐 스펙트럼 장애가 있는 환자의 혈장 프로테옴을 비교하여 질병 특이적 바이오마커의 조기 검출을 위한 잠재적 바이오마커로 사용할 수 있는 차별적으로 발현된 단백질을 식별하여 예후와 치료 결과를 크게 개선하는 것입니다. 잠재적 바이오마커 관련성이 있는 저농도 혈장 단백질을 검출하기 위한 샘플 준비 및 질량 분석 매개변수를 최적화하여 분석 프로세스의 민감도와 처리량을 개선합니다. 혈장에는 광범위한 단백질 농도가 포함되어 있어 저농도 바이오마커를 검출하기 어렵습니다. 최적화된 프로토콜은 임상적으로 관련 있는 바이오마커의 발견을 향상시킬 수 있습니다. 마지막으로, 표적 접근 방식 병렬 반응 모니터링(PRM)을 사용하여 발견 기반 질량 분석 연구에서 확인된 후보 바이오마커를 검증하여 재현성과 임상적 유용성을 보장합니다. 바이오마커의 검증은 발견 연구를 임상 응용 프로그램으로 전환하고 식별된 바이오마커가 진단 또는 치료 모니터링에서 신뢰할 수 있고 적용 가능한지 확인하는 데 중요합니다. 키워드: 바이오마커, 자폐 스펙트럼 장애, 비표적 프로테오믹스, 표적 프로테오믹스, 질량 분석법

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Autism spectrum disorder (ASD) is a complex neurodevelopmental condition characterized by a broad range of behavioral and cognitive manifestations, presenting significant challenges for early diagnosis. Consequently, identifying reliable biomarkers is essential to improve early detection and intervention strategies. Despite recent advances in ASD research, the absence of consistent biological markers remains a critical limitation, underscoring the need for robust biomarker discovery. This study seeks to identify and validate potential biomarkers for ASD through mass spectrometry-based proteomic analysis, aiming to uncover molecular patterns associated with the disorder and provide insights into underlying biological mechanisms. The identification of biomarkers for autism spectrum disorder is critically important for advancing early diagnosis, personalized treatment, and understanding the underlying mechanisms of the disorder. Biomarkers objective, quantifiable indicators of biological processes can aid in distinguishing ASD from other neurodevelopmental disorders, which is vital given the diverse presentations within the autism spectrum. Currently, ASD diagnosis relies primarily on behavioral assessments, which may lead to delayed diagnosis and intervention. Biomarkers, such as genetic, neuroimaging, or biochemical markers, offer the potential for earlier, more precise diagnosis and for tracking ASD related neurobiological changes over time. Identifying reliable biomarkers can also facilitate the development of targeted therapeutic strategies by linking specific biological pathways with clinical symptoms, ultimately contributing to improved outcomes and quality of life for individuals with ASD. Depleting high-abundance proteins in plasma is a critical step in identifying biomarkers for autism spectrum disorder. Plasma, while a rich source of potential biomarkers, contains a wide range of protein concentrations, with a small number of high-abundance proteins (e.g., albumin, immunoglobulins) comprising over 90% of its total protein content. These dominant proteins can mask the presence of low- abundance proteins, including those potentially linked to ASD pathophysiology, making their detection challenging. Depletion techniques allow for reducing or removing these high-abundance proteins, thus enriching the plasma for low-abundance proteins that may serve as informative biomarkers. By enhancing the sensitivity of downstream analytical techniques, such as mass spectrometry, depletion facilitates the discovery of novel and subtle molecular signatures associated with ASD, which may lead to improved diagnostic and therapeutic strategies. This thesis first aim is to compare the plasma proteome of healthy individuals and patients with an autism spectrum disorder to identify differentially expressed proteins that could serve as potential biomarkers for early detection of disease-specific biomarkers that can significantly improve prognosis and treatment outcomes. To optimize sample preparation and mass spectrometry parameters for the detection of low-abundance plasma proteins with potential biomarker relevance, improving the sensitivity and throughput of the analytical process. Plasma contains a wide dynamic range of protein concentrations, making it challenging to detect low-abundance biomarkers. Optimized protocols can enhance the discovery of clinically relevant biomarkers. Finally, validation of candidate biomarkers identified in discovery-based mass spectrometry studies using targeted approach parallel reaction monitoring (PRM) to ensure their reproducibility and clinical utility. Validation of biomarkers is critical for translating discovery research into clinical applications, ensuring that the identified biomarkers are reliable and applicable in diagnostics or therapeutic monitoring. Keywords: Biomarker, Autism spectrum disorder, untargeted proteomics, targeted proteomics, Mass spectrometry

목차 (Table of Contents)

• List of Contents
• Abstract.. i
• List of contents..iv
• List of tables..vi
• List of figures.vii
• Ⅰ. Introduction
• 1.1 Autism spectrum disorder (ASD)....1
• 1.1.1 Protein biomarkers....3
• 1.1.2 Metabolite biomarkers....7
• 1.1.3 Genetic biomarker..8
• 1.1.4 Cytokines and Immune system...9
• 1.2 Plasma as a Source for Biomarker Discovery...10
• 1.2.1 Advantages of Plasma as a Biological Sample...11
• 1.2.2 Challenges Associated with Plasma-Based Analysis..11
• 1.2.3 Impact of Plasma Variability on Biomarker Identification..12
• 1.2.4 Pre-Analytical and Analytical Challenges in Plasma Studies...13
• 1.2.5 Current Approaches to Plasma-Based Biomarker Discovery..14
• 1.3 Mass spectrometry for the discovery of biomarkers..15
• 1.3.1 Mass spectrometry-based protein identification techniques..16
• 1.3.2 Mass spectrometry-based protein quantification method..17
• 1.4 Rationale and objectives of the study....18
• 1.5 Significance and Impact of autism biomarker duiscovery.20
• II. Label-free proteomics analysis of autism family and control samples..22
• 2.1 Introduction..22
• 2.2 Results...23
• 2.2.1 Experimental design for label-free quantification..23
• 2.2.2 Label-free quantification for significant proteins...24
• 2.3 Discussion.25
• 2.4 Materials and Methods...26
• III. Labeling analysis to identify low abundant protein biomarker...30
• 3.1 Introduction.....30
• 3.2 Results....31
• 3.2.1TMT labeling experimental design....31
• 3.2.2Quantification of biomarker proteins..32
• 3.3 Discussion.....34
• 3.4 Materials and Methods...34
• IV. Targeted proteomics for validation of biomarker protein....40
• 4.1 Introduction....40
• 4.2 Results..41
• 4.2.1 Experimental design for PRM targeted proteomics analysis..41
• 4.3 Discussion.....42
• 4.4 Materials and Methods....43
• V. Conclusion...46
• Reference...49