Functional Role in Pre- and Postsynaptic AT_(1)Receptors in Purinergic and Noradrenergic Vasoconstriction in the Mesenteric Artery

국문 초록 (Abstract)

Angiotensin II의 수용체는 크게 AT₁, AT₂수용체로 나뉘어 진다. AT₁수용체 길항제인losartan은 선천성 고혈압쥐의 mesenteric 및 hindlimb의 혈관확장과 함께 혈압을 저하시켰다. 그러나, 맥박은 변화가 없었다. 혈압과 mesenteric 및 hindlimb의 혈관저항에 미치는 losartan의 효과는 ganglion의 차단에 의해 억제 또는 차단되었는데 이러한 결과는 선천성 고혈압쥐에서 관찰되는 losartan의 hemodynamic효과가 부분적으로는 중추신경계에 의해 매개될 수 있음을 시사한다. Mesenteric 혈관계는 총말초저항에 크게 관여하는 중요한 부위로,혈관저항은 purinergic 과 noradrenergic 기전에 의해 매개되는데, 이러한 기전들 angiotensin II에 의해 조절이 될 지도 모른다. Mesenteric 혈관계는 losartan의 중요한 작용부위이므로, 이 혈관계에서의 purinergic과 noradrenergic 혈관수축에 있어서 AT₁수용체의 역할을 평가하였다. Sprague-Dawley 쥐의 mesenteric 혈관상을 적출하여, angiotensinII를 전처리 하였을 때 , angiotensin II는 동맥주위신경의 자극 및 norepinephrine, phenylephrine에 대한 mesenteric 혈관상의 반응을 증강시켰으며,이러한 angiotensin II의 증강효과는 losartan에 의해 차단되었다. 토끼의 mesenteric 동맥에 있어서도, angiotensin II는 nicotine에 의해 유발된 혈관수축을 증강시켰으며, 이러한 증강효과는 losartan에 의해 차단되었다. 그러나,angiotensin II는 외인성ATP에 대한 mesenteric 혈관계의 반응에는 영향을 미치지 않았다. Losartan은 norepinephrine의 혈관수축에 대한 angiotensin II의 증강효과를 억제한 반면, phenylephrine의 혈관수축에 대한 angiotensin II의 증강효과는 억제하지 못했다. 그러나, indomethacin의 존재하에서는 phenylephrine의 혈관수축에 대한 angiotensin II의 증강효과가 losartan 에 의해 차단되었다. 이러한 결과는norepinephrine 에대한 mesenteric 동맥의 혈관수축반응에 미치는 angiotensin II의 증강효과는 postsynaptic AT₁수용체에 의해 매개되어 지지만, postsynaptic α
-adrenoceptor의 흥분에 따른 혈관 반응에 대한 angiotensin II의 증강효과는 angiotensin II에 의한 prostaglandin의 생성에 의해 상쇄될 수 있으며, 이는 아마도 AT₁수용체에 의한 것 임을 시사한다. Losartan자체는 indomethacin의 부재시 norepinephrine 및phenylephrine 에 대한 토끼 mesenteric동맥의 혈관반응을 증강시켰다. 그러나, indomethacin의 존재시에는 losartan은 phenylphrine의 반응을 억제하였다. 이러한 결과는 내인성 angiotensin II가 noradrenergic혈관수축을 증강시키는 것 같으나, 이러한 효과는 angiotensin 에 의한 prostaglandin의 생성에 의해 상쇄될 수도 있으며, 이는 아마도AT₁수용체에 의해 매개되는 것임을 시사한다. Angiotensin II는 Ca++- free buffer에서 norepinephrine에 대한 토끼 mesenteric동맥의 혈관수축을 증강하였으며, 이는 phospholipase C억제제인, 2-Nitro-4-carboxyphenyl-N,N-diphenylcarbamate (NCDC)에 의해 차단되었다. Losartan은 토끼 mesenteric 동맥에서 nicotine에 의해 유발된 혈관수축반응 중 noradrenergic 부분에 대한 angiotensin II의 증강효과를 차단하였으며, 또한 nicotine에 의해 유발된 혈관수축반응 중 noradrenergic 부분에 미치는 ATP의 억제효과에 대한 angiotensin II의 길항작용을 차단하였다.
결론적으로, AT₁수용체는 mesenteric 동맥에서 purinergic 및 noradrenergic neurotransmission 에 대한 angiotensin II의 증강효과를 매개하는 것으로 생각된다. Postsynaptic AT₁수용체는 phospholipase C를 통해 polyphosphoinositide 의 가수분해를 촉진시켜 norepinephrine에 대한 혈관의 반응을 증강시키는 것으로 보인다. Angiotensin II는 norepinephrine과 함께 cotransmitter로 분비되어 noradneric neurotransmission,특히 norepinephrine 의 분비를 억제하는 ATP에 대한 생리적 길항제로 작용한다고 생각된다. 따라서, 교감신경계의 neuroeffector junction에 위치하고 있는 AT₁ 수용체에 대한 losartan의 작용이 losartan의 혈압강하효과에 기여할 수 있으며, 이러한 효과는 noradrenergic 및 purinergic부분을 모두 포함하고 있는 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The bacteriophage λO protein localizes the initiation of replication to a unique sequence, ori λ through specific protein-DNA and protein-protein interactions.
Conformational changes at ori λ introduced by O protein binding have been reported and their roles have been implicated in the initiation of λ DNA replication. In our studies, we focused on detailed structural basis of the formation of the O protein-ori λ complex(O-some). This work was divided into five Chapters including a general introduction given in Chapter 1, a brief review of genetic, biochemical, and structural data for understanding the mechanism of the initiation of λ DNA replication. As shown in Chapter 2, we found that the O protein exists as a dimer and demonstrated that the active DNA binding species is also a dimer. Dimerization and sequence-specific DNA recognition are specifically mediated through the amino-terminal half of O(O1-162(아래첨자 1-162입력불가)). The binding affinity of O for a single copy of its 19 bp recognition sequence was 2-3 nM.
We also found that the O-some is composed of 4 dimers of O and ori λ DNA, which contains four 19 bp direct repeat recognition sites, i, e., a dimer of O is bound to each repeat(iteron). Moreover, we found that only the amino-terminal DNA binding domain is required for formation of the O-some.
To investigate the structural basis for the unique properties of O protein, we generated a number of carboxy-terminal and internal and internal deletion mutants of O. Experiments with purified mutant proteins, as shown in Chapter 3, indicated that (ⅰ) the deletion mutant retaining amino acid residues 19-110 is the smallest O protein species that can both bind to DNA and form a dimer, (ⅱ) the affinities of all mutant proteins for a single iteron are almost the same, ranging from 2 to 4 nM; (ⅲ) the portion of O that is responsible for dimerization is located between amino acid residues 19 and 85; (ⅳ) the carboxy-terminal domain (O 156-299(아래첨자 156-299입력불가)) is a monomeric species that does not recognize specific DNA sequences but instead, bind non-specifically to duplex DNA; (ⅴ) the linker joining the two structural domains is not required for O function, but its coding sequence of DNA contains several recognition sites for O protein (ori λ); and (ⅵ) a deletion!
m!
utant missing the amino-terminal portion of the carboxyl-terminal domain is still comparably active in the in vitro λdv replication assay.
In Chapter 4, the structural basis of the O protein-DNA complex was studied in detail. Hydroxy radical footprinting was employed to obtain the high resolution structural information about the contacts between the protein and the sugar-phosphate backbone of DNA. The missing nucleoside experiment allowed us to identify energetically important base moieties that may be in contact with bound O protein.
Quantitation of the extent of O-mediated DNA bending indicated that O induces a relatively sharp bend in an individual recognition sequence of 85。 ±5。 . Measurement of the O-induced topological change indicated that a region of DNA or specifically ori λis wrapped around the O protein core in a left-handed fashion with a linking number change of 0.7±0.1 turn.
In Chapter 5, we present direct evidence that the O protein also has the capacity to interact with single-stranded DNA, the first such interaction discovered among prokaryotic origin-binding proteins. The implication of this dual DNA binding specificity of O for the formation of the unwound structure at the A/T-rich region of ori λ is dis cussed. The addition of the λP-DnaB comple x to the O-some produces a new nucleoprotein species with a super-shift in migration. The presence of P and DnaB reduces significantly the amount of O required for binding to single-stranded DNA.
Based on these results, we propose a detailed model for sequential structural changes in ori λ as a consequence of O binding to the origin of λreplication.