Pathogenesis of Mouse Hepatitis Virus A59 Infection in C1qa Knockout Mice = C1qa 결핍 마우스에서 마우스 간염 바이러스 A59의 감염의 병리발생 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Mouse hepatitis virus (MHV) is one of the most contagious pathogens threatening laboratory mice. MHV A59 is a highly infectious and polytropic strain. In general, the infection of MHV A59 starts at respiratory tract and progresses to systemic infection. C1q forms C1 complex and initiates the classical complement pathway of the complement system. In this study, MHV A59 was infected in C57BL/6J-C1qa knockout (C1qa KO) mice to compare the pathogenesis of MHV systemic infection.
C1qa KO and C57BL/6J (wild type) mice were inoculated with MHV A59 by intranasal route. Mice were sacrificed 3 and 6 days of post infection. In necropsy, brain, liver, lung, spleen and intestine were sampled for molecular and histopathological analysis. Brain was separated into olfactory bulb, cerebrum, cerebellum, hypophysis and spinal cord. Viral RNA in each organ was measured by a real-time PCR method.
MHV A59 infection in C1qa KO showed similar grade of histopathologic changes with those of wild type mice 3 dpi, but more severe lesions were observed 6 dpi compared to wild type mice; interstitial pneumonia, multifocal hepatitis. In contrast, the lesions of wild type mice were mild 3 and 6 dpi. IL-10, TNF-α, IFN-γ, MIP-1α and MCP-1 expression levels in spleen showed upregulation in C1qa KO mice than wild type mice. Chemokine upregulation was consistent with viral loads and histopathologic changes. Virus copy number in olfactory bulb, liver, lung and large intestine of C1qa KO mice was significantly higher than that of wild type mice. Viral copy number of C1qa KO mice was related to histopathologic changes of organs. These results suggest that C1qa deficiency enhances susceptibility to MHV A59 systemic infection and activation of classical complement pathway might be important in protecting host against MHV A59 infection.

국문 초록 (Abstract)

Mouse hepatitis virus (MHV)는 실험동물에 있어서 전염성이 강한 병원체이다. 그 중에서 MHV A59는 전염성이 매우 높고 전신 장기에 감염이 가능한 바이러스이다. 성체 마우스에서는 심각한 임상증상을 나타내지 않지만, 어린 마우스나 면역이 저하된 마우스에서는 탈수초성 뇌염, 다발성 경화증, 간염 등의 증상을 일으킨다. C1q는 C1r, C1s와 함께 C1 복합체를 형성하여 보체 경로를 개시하는 보체계의 단백질 복합체로, 고전 보체 경로를 개시하는 역할을 한다. 본 연구에서는 정상 마우스와, C1qa를 발현하는 유전자 결핍으로 면역이 저하된 마우스에게 mouse hepatitis virus를 감염시켜 바이러스 감염에 있어서 고전 보체 경로의 역할을 알아보고자 하였다.
C1qa 결핍 마우스와 C57BL/6J (wild type) 마우스에 MHV A59를 비강 내 주입 방법으로 감염시켰다. 마우스의 체중은 매일 측정하였고, 실험 마우스는 감염 후 3일 차, 6일에 각각 안락사시켰다. 부검 시에는 분자 생물학적 분석과 조직병리학적인 검정을 위해 뇌, 간, 폐, 비장, 공장, 결장을 분리하였다. 뇌는 각각 후각 망울, 대뇌 피질, 소뇌, 뇌하수체, 척수로 분리하였다. 감염 장기 내에 바이러스의 RNA양을 측정하기 위해 real-time PCR 방법을 이용하였다.
C1qa 결핍 마우스와 C57BL/6J 마우스 모두 MHV A59 감염 3일에는 비슷한 정도의 병변을 보였으나, 감염 6일에서 C1qa 결핍 마우스가 정상 마우스인 C57BL/6J 마우스에 비해 심한 간질성 폐렴, 다발성 간염 등의 병변을 보였다.
비장 내 사이토카인의 발현량을 측정하기 위해 마찬가지로 real-time PCR 법을 이용했다. C1qa 결핍 마우스에서 각각 사이토카인의 발현량이 더 높은 것으로 확인했다. 면역이 저하된 C1qa 결핍 마우스는 감염 장기에서의 바이러스 RNA 발현량과 비장의 사이토카인 발현량이 모두 높은 것으로 나타났다. 이는 조직병리학적 평가에서도 염증세포 침윤과 염증의 정도를 보았을 때 일치하는 결과이다.
이러한 결과에서 C1qa의 결핍은 MHV A59의 전신 감염력을 증폭시키며, 고전 보체 경로가 MHV A59의 감염으로부터 숙주를 지키는데, 중요하다는 것을 알 수 있다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 4
• 2.1. Cell and viral stock preparation 4
• 2.2. Animals 5
• 2.3. Anesthesia and mouse hepatitis virus inoculation 8
• 2.4. Quantification of viral RNA in each organ 9
• 2.4.1. Viral gene isolation for viral loads analysis 9
• 2.4.2. Viral gene loads analysis with real-time PCR methods 9
• 2.5. Quantification of mRNA expression level in spleen 12
• 2.5.1. Reverse transcription polymerase chain reaction 12
• 2.5.2. Quantitative real-time polymerase chain reaction 12
• 2.6. Histopathological analysis 14
• 2.6.1. Hematoxylin and eosin (H&E) staining 14
• 2.6.2. Immunohistochemistry 14
• 2.6.3. Quantification with histopathological scoring 15
• 2.7. Statistical analysis 17
• 3. Results 18
• 3.1. Body weight changes 18
• 3.2. Organ to body weight ratio 20
• 3.3. Measuring viral loads in susceptible organs 22
• 3.4. Histopathology and immunohistochemistry 24
• 3.4.1. Hematoxylin and eosin staining and immunohistochemistry 24
• 3.4.2. Histopathological scoring of liver 31
• 3.5. Cytokine and chemokine expression levels in spleen 33
• 4. Discussion 36
• References 39
• Abstract (in Korean) 45