Protease proteomics기술을 이용한 파킨슨병 관련 신규 바이오마커의 발굴 및 기능 규명 = Identification of novel biomarker associated with a progression of Parkinson's disease using protease proteomics

국문 초록 (Abstract)

1. 연구개발의 목적 및 필요성
: immobilization 및 liquid-based protease proteomics기술을 응용한 질환관련 새로운 인자의 대량 발굴
: 파킨슨병의 질환모델에서 상기 기술을 이용하여 신경세포사멸시에 활성화되는 특정protease (caspase-3 및 calpain)로 절단되는 신규 세포내 기질 단백질 (endogenous substrate protein)의 발굴
: 발굴 신규 세포내 기질단백질의 절단여부가 신경세포사멸을 조절하는 기능 및 기전을 규명
(gain-of-function 또는 loss-of-fucntion)
: 발굴 신규 세포내 기질단백질의 유용성을 질환의 동물모델 및 postmortem brain을 사용하여 재차 검증
: 질병의 진단 및 치료제개발의 신규 바이오마커로 활용할 수 있는 과학적 근거의 제공을 목표로 함
2. 연구개발의 내용 및 범위
- 연구모델 : Neurotoxin의 처리로 특정 protease의 활성화 (caspase, calpain 또는 caspase/calpain동시 활성화모델)가 동반되는 질병의 세포배양 및 동물모델의 활용
- 연구전략 : 자체 개발된 Immobilization/liquid-based protease proteomics기술을 통한 세포내 기질단백질의 발굴전략 및 활용
: Immobilization-based protease proteomics기술 : 1차 전기영동으로 immobilized된 단백질 strip에 선택된 protease를 반응시켜 해당 protease에 의해서 직접적으로 절단되는 세포내 기질만을 발굴하는 전략을 사용
: Liquid-based protease proteomics기술 : 획득된 liquid 상태의 cellular (tissue) lysate를 선택된 protease를 처리하여 해당 protease에 의해 직접 및 간접적으로 절단되는 세포내 기질군의 동시에 발굴하는 전략의 사용
- 발굴 세포내 기질단백질의 검증 : 상기와 같은 forceful reaction으로 대량 발굴된 세포내 기질단백질의 유용성 검증
: 해당 타겟의 metabolic labeling에 의한 In vitro assay 및 cell-based assay를 통한 검증
: 해당 protease의 활성이 확립된 동물 및 세포배양 질병 모델을 이용하여 병리학적인 상황에서 발굴 세포내 기질단백질에 대한 항체를 사용하여 절단여부의 검증하는 전략의 채택
- 신규 세포내 기질단백질에 의한 신경세포사멸조절 기능 및 관련 기전의 규명
: 발굴 세포내기질의 wild-type, 절단부위에 대한 point mutant, N- 및 C-terminal sequence가 과발현하는 모델을 이용하여 절단여부가 gain 또는 loss-of-function인지의 기능 규명 (전자현미경등을 이용한 형태검증, MTT assay, FACS 분석 등)
: RNA interference 방법을 이용한 stable knock-down 모델을 이용한 기능 규명
: 발굴 세포내 기질단백질의 절단에 따른 결합단백질의 profile변화 및 세포내 소기관으로의 이동등이 신경세포사멸을 조절 기전의 발굴 (Co-immunoprecipitation/mass spectrometry 및 confocal microscope등을 활용)
- 질병의 신규 바이오마커로서의 위상 규명
: 파킨슨질환을 포함한 기타의 퇴행성신경계질환의 동물모델등을 이용하여 further validation을 실시하여 신규 기질단백질 절단의 선택성 여부의 판정 (stereotaxic injection모델, middle cerebral artery occlusion모델, New York contusion법에 의한 spinal cord injury모델, ALS생쥐 모델등)
: 이미 수집된 치매 및 파킨슨질환 환자의 postmortem brain을 이용한 최종 검증
3. 연구개발 결과
◦2종 이상의 특이적인 모델에서의 신호전달체계의 규명
◦이를 활용한 새로운 세포내 기질의 발굴의 시도
◦자체적으로 개발된 두가지 방법을 통한 기질 발굴의 protocol의 확립
◦이를 활용한 총 44종의 새로운 세포내 기질의 발굴
◦발굴된 새로운 기질 단백질에 대한 metabolic labling 및 세포내로 transfection시키는 방법을 통한 발굴 target의 유효성 검증 완료
◦6-OHDA 및 MPP+의 처리로 생성된 병리학적인 모델에서 발굴 target의 유효성 검증 완료
◦발굴단백질의조직내의 분포도규명
◦ 동물모델 및 사후 뇌에서의 절단여부의 재차 검증 : Middle cerebral artery 결절모델 및 spinal cord contusion model을 제조/발굴기질의 절단여부의 검증포함 •RNA interference 방법을 이용한 stable knock-down 모델을 이용한 기능 규명
◦PICOT단백질의 발굴 성공
◦PICOT의 다양한 mutant form의제조 및 이를 활용한 anamorsin과의 결합부위의 mapping
◦PICOT단백질의 절단여부의 검증을 통해 새로운 기질의 발굴
•non-cleavable mutant를 활용한 절단여부가 신경세포사멸을 조절하는 기능의 규명
•질병의 진단/치료용 biomarker로서의 가능성 제시를 하였음
4. 연구개발의 활용계획
- 기대효과 및 활용방안
: 자체개발 protease proteomics기술 기반확립을 통한 신규 원천기술로 활용 및 기술지원 효과 기대
: 파킨슨질환에 동반되는 도파민성신경세포의 사멸과정을 조절하는 신규타겟의 발굴, 관련기전의 제시 및 질병의 바이오마커로서의 활용방안 기대
: 질병의 조기진단 및 치료제 개발의 중요 타겟으로 활용에 기여
: 발굴 타겟을 조절하는 유효성분을 chemical library 및 천연물뱅크등에서 발굴하는 향후의 연구개발에 활용이 기대됨
- 과학적인 기대효과
: 최근의 연구개발동향인 <neuroprotection> 및 <neurorestoration>에 준하는 신경세포사멸관련 새로운 인자를 발굴하는 과학적 근거를 제공
: 우수 해외저명학술지에 게제될 가능성을 기대</neurorestoration></neuroprotection>

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Parkinson's disease is the second common neurodegenerative disease and patients with the disease show a typical movement disorder including akinesia, tremor, bradykinesia and postural instability. Degeneration and death of dopaminergic neurons in the substantia nigra is thought to be responsible for the progression of the disease. However, biochemical and molecular characterization of neuronal death remains to be extensively determined. In consideration of both a limited accessibility of stage-specific live patients of the neurodegenerative diseases in general, and heterogeneity and paucity of dopaminergic neurons in the affected area, we have adapted a strategy to initially run proteome analysis on the stage- and cell death type (mode)-specific in vitro culture and in vivo animal model to massively identify potentially important molecular targets and pathways. Furthermore, we have adapted a strategy to validate these targets and pathways for their correlation with the progression of the disease. To meet this end and take advantages of our model systems, several strategic approaches are considered and made. These include protease proteomics, fractionalional proteomics and post-translational modification proteomics. In this proposal we specifically developed the gel-based protease proteomics in which novel endogenous substrates of capsase-3 can be multiply identified. Overall schemes of identifying novel molecules and their potential cell death-regulating activity was further examined in the entire process of conducting experiments. Outcome of the subsequent studies on the newly identified protein, anamorsin and its binding partner, PICOT will eventually expand our understanding of pathophysiology underlying progression of Parkinson's disease. We published on paper in Journal of Neural Transmission and two others will appear in other journals within 2 years.