The expression of Cdk inhibitors, p27^(kip1) and p57^(kip2), in mouse and human reproductive tissue

국문 초록 (Abstract)

발생중인 개체의 세포의 증식은 CDKs (cyclin-dependent kinases)를 조절하기 위한 세포 내, 외의 복잡한 신호전달 과정들에 의해 조절된다. 정상적인 발생을 위해서는 서로 다른 cyclin-Cdks의 활성과 불활성을 통한 세포의 증식과 분화가 적절한 시기에 조절되는 것이 필수적이다. 자궁내막의 증식과 분화는 난소의 스테로이드 호르몬에 의해 조절된다고 알려져 있다. 난소의 에스트로겐은 선상피세포 (glandular cells)의 증식을 유도하는데 반해, 프로게스테론은 그것의 성장을 억제하며 분비샘으로의 변화를 유도한다. 태반은 포유류 배아발생과정에서 처음으로 형성되는 기관으로, 기능과 형성과정에 문제가 생기면 임신초기 유산과 임신 합병증을 일으킬 수 있다. 태반은 모체와 태아 사이에 위치하여 가스, 영양분 및 노폐물의 교환 등의 기능을 한다. 또한 임신과 관련된 호른몬, 성장인자의 공급처이며, 모체의 면역거부반응으로부터 태아를 보호해 주는 역할을 하고 있다. 따라서 포유류 배아의 발생을 위해서는 정상적인 기능을 할 수 있는 태반의 형성이 필수적이다. 포유류 정소의 세정관은 감수분열과 분화를 통해 정자를 형성하는 생식세포의 증식이 매우 복잡하고 다양하게 이루어지는 조직으로, 정상적인 발생을 위해서 매우 다양한 인자들에 의해 생식세포의 주기가 조절된다.
따라서 본 연구는
1) 생쥐의 발정주기와 임신기 동안 자궁내막에서, 2-1) 사람의 정상 생리주기와 자궁내막 증식증, 자궁내막암 조직의 자궁내막에서, 2-2) 체외배양을 통한 탈락막 유도 과정 중 사람의 자궁내막 기질세포에서, 3-1) 생쥐 태반의 성장과 분화과정에서, 3-2) 사람의 choriocarcinoma JEG-3 세포의 배양과정에서, 4) 생쥐 정소의 생후 발생과정에서, 5) 다양한 질환의 사람 정소조직에서 CDK inhibitor인, p27^(kip1)과 p57^(kip2)의 발현양상을 다음과 같은 조직에서 확인하고자 하였다:
그 결과는 다음과 같다:
1) 생쥐의 발정주기동안 p27^(kip1)과 p57^(kip2) mRNA의 발현은 발정기 (estrus)와 발정후기 (metestrus)보다는 발정전기 (proestrus)와 발정말기 (diestrus)에서 높게 나타났다. 발정말기에서 p57^(kip2)의 면역조직화학 결과, 탈락막 세포 또는 퇴화되는 기질세포의 일부분에서 강하게 염색되었다. 발정전기에서는 기질세포에서 전반적으로 강하게 p57^(kip2)가 염색되었다. 그러나 발정기에서는 p57^(kip2)가 매우 낮은 발색반응을 보였고, 발정후기에서는 탈락막세포에서 부분적으로 강하게 반응을 나타내었다. 발정주기와는 대조적으로 임신기 자궁내막에서는 p27^(kip1)과 p57^(kip2) mRNA level이 높게 유지되었다 (임신 5일 p27^(kip1)를 제외하고). p57^(kip2) 단백질은 임신 1일에서 2일까지는 비교적 적게 발현되다가 임신 3일과 4일에 일부 기질세포에서 비교적 강하게 발현되었다. 그리고 임신 5일에서 6일째에 이르러 탈락막세포에서 발현이 강하게 나타남을 확인하였다.
2) 사람의 생리주기동안 p57^(kip2) mRNA는 분비기에 증가하였고,자궁내막 증식증과 자궁내막암 조직에서는 생리주기의 증식기와 비슷한 수준으로 발현이 낮았다. 자궁내막 증식증과 자궁내막암 조직에서는 p57^(kip2) 단백질이 선상피세포와 기질세포 모두에서 거의 검출되지 않았다. 생리주기동안 선상피세포에서 p57^(kip2) 단백질의 발현은 초기 분비기에서 중기 분비기까지 유의하게 증가하였으나, 후기 분비기에서는 발현이 미약하였다. 기질세포에서는 후기분비기에서 보다 더 강한 염색을 확인하였다. 체외배양을 통한 탈락막유도 과정에서 p27^(kip1)과 p57^(kip2) mRNA 모두 점차 증가하는 양상을 나타내었다. 또한 프로게스테론에 의해서 p57^(kip2)는 발현이 증가되었다.
3) 생쥐의 태반에서 다른 그룹에 비해 임신 18일 태반에서 p27^(kip1) mRNA의 발현이 증가하였다. 반면 p57^(kip2) mRNA는 임신 18일 보다는 임신 12, 14, 16일에서 높은 발현을 보였다. 단백질 발현 양상은 mRNA와 유사하였는데, 특히 p57^(kip2) 단백질은 임신 14일 태반에서 높게 발현되었다. 면역조직화학 실험에서 p27^(kip1) 단백질은 임신 12일에서 18일까지 labyrinth zone에서 점차 증가하였다. 반면에 p57^(kip2) 단백질은 감소하는 경향을 나타내었다. 이러한 p27^(kip1)과 p57^(kip2)의 경향성은 decidua와 spongiotrophoblast에서도 나타났다.
4) 사람의 choriocarcinoma JEG-3 세포에서 p27^(kip1) mRNA는 에스트로겐 처리 농도에 상관없이 매우 약하게 발현되었고, p57^(kip2)는 발현되지 않았다. JEG-3 세포에 glucocorticoid인 dexamethasone (DEX)을 다양한 농도로 5일간 처리한 결과, 대조군에 비해 5 ng 처리군에서 p27^(kip1) mRNA 발현이 현저하게 증가하였다. 50 ng 처리군에서는 보다 더 증가하였으나, 500 ng 처리군에서는 50 ng 처리군보다 약간의 감소 현상을 보였다. 역시 p57^(kip2)는 발현되지 않았다.
5) 사춘기 (생후 28일)와 성체 생쥐보다는 미성숙 생쥐의 정소 (생후 7일, 14일)에서 p57^(kip2) mRNA의 발현이 유의하게 높았다. 생후 7일 정소에서 p57^(kip2) 단백질은 세정관 전체 생식세포와 체세포에서 광범위하게 발현되었다. 생후 14일 정소에서는 정원세포 (spermatogonia)에서, 사춘기 정소에서는 정원세포와 Leydig 세포에서 p57^(kip2)가 매우 강하게 발현되었다. 성체 생쥐의 정소에서는 아주 일부분의 정원세포와 Leydig 세포에서만 p57^(kip2) 단백질이 발현되었다.
6) 사람의 정상 정소에서 p57^(kip2)는 많은 정원세포에서 매우 강하게 발현되었다. 또한 비폐쇄성 무정자증 환자의 정소에서도 일부분의 정원세포에서 발현이 확인되었다. 감소된 정자형성 양상을 보인 정소에서는 p57^(kip2)가 정원세포에서 약하게 발현되었다. 하지만 Sertoli cell-only syndrome 환자와 정소암 환자의 조직에서는 p57^(kip2) 단백질의 발현을 확인할 수 없었다.
이러한 결과로 p27^(kip1)과 p57^(kip2)이 생쥐의 발정주기와 착상을 위한 자궁내막의 분화에 중요한 역할을 할 것으로 사료되며, 특히 p57^(kip2)은 착상의 유지를 위한 자궁내막의 분화에 결정적인 역할을 할 것으로 사료된다. 또한 이전 연구로 알려진 바에 덧붙여 p27^(kip1) 뿐만 아니라 p57^(kip2)도 사람의 생리주기동안 자궁내막 선상피세포와 기질세포의 증식억제와 분화에 관여할 것으로 사료되며, 특히 악성 종양화된 선상피세포의 성장 억제와 후기 분비기 기질세포의 탈락막화에 중요한 기능을 할 것으로 사료된다. 그리고 생쥐 태반 발생 과정에서 p27^(kip1)은 후반기 발달 과정에, p57^(kip2)는 중반기 발달 과정에 중요한 기능을 할 것으로 생각되며, p27^(kip1)은 사람의 choriocarcinoma 세포의 증식을 억제하는데 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. 또한 생쥐의 생후 정소발달과정에 p57^(kip2)가 중요한 역할을 할 것으로 사료되며, 사람의 정소에서 정원세포의 분화와 악성종양 생식세포의 성장 억제에도 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cell proliferation in a developing organism is controlled by a complex network of signaling pathway that integrate information from the extracellular and intracellular environments to regulate cyclin-dependent kinases. Regulation of cellular growth and differentiation through the activation and inactivation of different cyclin-Cdks (cyclin-dependent kinases) at appropriate times is needed for normal development. It is well known that proliferation and differentiation of the endometrium are controlled by ovarian steroids via their receptors. Oestrogen stimulates the proliferation of glandular cells, whereas progesterone inhibits their growth and induces secretory changes. The placenta is the first organ to form during mammalian embryogenesis. Problems in its formation and function underlie many aspects of early pregnancy loss and pregnancy complications. It acts as the interface between the fetal and maternal environments, and is needed for exchange of gases, nutrients and waste products between mother and fetus. In addition, the placenta acts as an important source of pregnancy-associated hormones and growth factors, and is involved in immune protection of the fetus. Therefore, the development of the mammalian embryo depends critically upon the formation of a functional placenta. The seminiferous epithelium of the mammalian testis is a complex and highly dynamic tissue in which germ cells proliferate, undergo meiosis and differentiate into spermatozoa. Cell cycle in these tissues is regulated by many different factors to normal development.
Therefore, this study is to investigate the expression of CDK inhibitors, p27^(kip1) and p57^(kip2); 1) in mouse endometrium during the estrus cycle and pregnant period, 2-1) in human endometrium during the normal menstrual cycle and pathological tissues, endometrial hyperplasia and cancer, 2-2) in human endometrial stromal cells (ESC) during in vitro decidualization, 3-1) during the growth and differentiation of mouse placenta, 3-2) in human choriocarcinoma JEG-3 cells, 4) during the postnatal growth and differentiation of mouse testis, 5) in adult human testis with various defects.
The results were obtained as follows:
1) p27^(kip1) and p57^(kip2) mRNA was highly expressed in diestrus and proestrus stage than estrus and metestrus stage. In diestrus stage, immunoreactivity of p57^(kip2) was heterogeneously strong in parts of decidualized or degenerated stromal cells. In proestrus stage, strong immunoreactivity p57^(kip2) was largely found in stromal cells. But, p57^(kip2) was showed low immunoreactivity in estrus stage. In metestrus stage, immunoreactivity of p57^(kip2) was heterogeneously strong in decidualized stromal cells. In comparison with estrus cycle, p27^(kip1) and p57^(kip2) mRNA level was highly maintained in gestational endometrium (except p27^(kip1) of day 5 p.c). p57^(kip2) protein level was relatively low from day 1 p.c. to day 2 p.c. In day 3 and 4 p.c., immunoreactivity of p57^(kip2) was strong in some endometrial stromal cells. In day 5 and 6 p.c., immunoreactivity of p57^(kip2) was strong in decidual cells.
2) During the menstrual cycle, mRNA level of p57^(kip2) was significantly increased in secretory phase. p57^(kip2) mRNA expression in endometrial hyperplasia and cancer was low as proliferative phase. Expression of p57^(kip2) protein was detected in neither glandular nor stromal cells at proliferative phase, endometrial hyperplasia and cancer. The expression of p57^(kip2) in glandular cells was significantly increased from early to mid-secretory phase, but was faint in late secretory phase. In stromal cells of late secretory phase, the intensity of the staining for p57^(kip2) was much stronger than that of early and mid-secretory phase. The ESC were cultured with E_(2)+P_(4) for up to 14 days. The mRNA level of p27_(kip1) and p57_(kip2) was gradually increased during in vitro decidualization. The p57_(kip2) in human ESC was dominantly up-regulated by progesterone in vitro culture.
3) The p27^(kip1) mRNA in mouse placenta was highly expressed in 18 days p.c. than that in other groups. But, p57^(kip2) mRNA expression was high in 12, 14, and 16 days p.c., then decreased in 18 days p.c. The p27^(kip1) protein expression pattern was similar to mRNA. But, p57^(kip2) expression was higher in 14 days p.c. than other groups. The p27^(kip1) protein in mouse placenta was gradually increased in labyrinth zone from 12 days to 18 days p.c. However, p57^(kip2) protein was slightly decreased in labyrinth zone from 12 days to 18 days p.c. These reverse patterns of p27^(kip1) and p57^(kip2) expression were also shown in decidua and spongiotrophoblast.
4) The p27^(kip1) mRNA expression was very low in human choriocarcinoma JEG-3 cells with estradiol concentration-independent manner. The p57^(kip2) mRNA was not detected in JEG-3 cells. The JEG-3 cells were treated with glucocorticoid dexamethasone (DEX) of various concentrations for 5 days. In 5 ng DEX-treated groups, p27^(kip1) mRNA was dramatically increased in comparison with control groups. Also p27^(kip1) was significantly increased in 50 ng DEX-treated groups in comparison with 5 ng DEX-treated groups. But, p27^(kip1) was slightly decreased in 500 ng DEX-treated groups. The p57^(kip2) was not also expressed in these groups.
5) The mRNA expression of p57^(kip2) was higher in immature (7 and 14 days after birth) testis than pubertal (28 days) or adult (50 days) mouse testis. In 7 days mouse testes, moderate p57^(kip2) immunoreactivity was largely found in spermatogenic and somatic cells in the seminiferous tubules. In 14 days mouse testes, intensive immunoreactivity of p57^(kip2) was found in spermatogonia. In pubertal mouse testes, p57^(kip2) immunoreactivity was very strong in nucleus of some spermatogonia and Leydig cells. Also in adult mouse testes, intensive immunoreactivity of p57^(kip2) was found in nucleus of some spermatogonia and Leydig cells.
6) In normal human testis, very intensive immunoreactivity of p57^(kip2) was found in nucleus of many spermatogonia. Also in non-obstructive azoospermic testis, some spermatogonia were strongly stained. In seminiferous tubule of spermatogenic hypoplasia, p57^(kip2) was weakly expressed in some spermatogonia. However, in the seminiferous tubule of Sertoli cell-only syndrome and testicular cancer patients, there was no visible sign of p57^(kip2) expression.
These results suggest that p27^(kip1) and p57^(kip2) may play a role in endometrial differentiation for regular estrus cycle and implantation of mouse, and especially p57^(kip2) may play an essential role in endometrial differentiation for maintenance of implantation. Also p57^(kip2) as well as p27^(kip1) is involved in the growth suppression and differentiation of human endometrial glandular and stromal cells throughout the menstrual cycle, in growth inhibition of malignant glandular cells and in decidualization of stromal cells in late secretory phase. And these results suggest that p27^(kip1) may play a role in late period of mouse placental development and in growth inhibition of human choriocarcinoma cells, and p57^(kip2) may play a role in middle period of mouse placental development. These results suggest that the role of p57^(kip2) might be required for the postnatal development of mouse testis and that p57^(kip2) in human testis is involved in the differentiation of spermatogonia, and in growth inhibition of malignant germ cells.

목차 (Table of Contents)

• 목차 = ⅰ
• List of Tables = ⅶ
• List of Figures = ⅷ
• Acknowledgement = xiii
• Abstract = xiv
• Introduction and Backgound = 1
• Chapter Ⅰ The expression of Cdk inhibitor, p27^(kip1) and p57^(kip2), in mouse and human endometrium = 19
• Ⅰ. Introduction = 19
• Ⅱ. Materials and methods = 23
• 1. Animal and Tissues = 23
• 2. Human endometrium collection = 25
• 3. Human endometrial cell culture = 26
• 1) Tissue collection = 26
• 2) Isolation and culture of endometrial stromal cells (ESC) = 26
• 4. Total RNA extraction = 28
• 5. Reverse Transcription (RT) = 28
• 6. Polymerase Chain Reaction (PCR) = 29
• 7. Densitometry = 33
• 8. Immunohistochemistry = 33
• Ⅲ. Results = 35
• 1. Optimization of RT-PCR = 35
• 2. p27^(kip1) and p57^(kip2) mRNA expression in mouse endometrium during estrus cycle = 35
• 3. Immunohistochemistry of p57^(kip2) protein in mouse endometrium during estrus cycle = 44
• 4. p27^(kip1) and p57^(kip2) mRNA expression in mouse endometrium during pregnant period = 44
• 5. Immunohistochemistry of p57^(kip2) protein in mouse endometrium during pregnant period = 50
• 6. p27^(kip1), p57^(kip2), and prolactin (PRL) mRNA expression in human endometrium = 53
• 7. Immunohistochemistry of p57^(kip2) in human endometrium = 57
• 8. p27^(kip1), p57^(kip2) and PRL mRNA expression in human endometrial stromal cells (ESC) during in vitro decidualization = 60
• 9. mRNA expression in human endometrial stromal cells (ESC) according to differently hormonal treatment for 6 days = 65
• Ⅳ. Discussion = 70
• Chapter Ⅱ The expression of Cdk inhibitor, p27^(kip1) and p57^(kip2), in placenta = 76
• Ⅰ. Introduction = 76
• Ⅱ. Materials and methods = 80
• 1. Animals and tissues = 80
• 2. Total RNA extraction = 80
• 3. Reverse Transcription (RT) = 81
• 4. Polymerase Chain Reaction (PCR) = 82
• 5. Densitometry = 82
• 6. Western blotting = 83
• 7. Immunohistochemistry = 84
• 8. Cell culture = 85
• Ⅲ. Results = 87
• 1. Optimization of RT-PCR of p57^(kip2) = 87
• 2. p27^(kip1) and p57^(kip2) mRNA expression In mouse placenta during gestation = 87
• 3. p27^(kip1) and p57^(kip2) protein expression In mouse placenta during gestation = 93
• 4. Immunohistochemistry of p27^(kip1) protein in mouse placenta during gestation = 96
• 5. Immunohistochemistry of p57^(kip2) protein in mouse placenta during gestation = 100
• 6. p27^(kip1) and p57(kip2) mRNA expression in JEG-3 cells = 105
• Ⅳ. Discussion = 108
• Chapter Ⅲ The expression of Cdk inhibitor, p27^(kip1) and p57^(kip2), in mouse and human testis = 112
• Ⅰ. Introduction = 112
• Ⅱ. Materials and methods = 117
• 1. Animal and tissues = 117
• 2. Human testis = 117
• 3. Total RNA extraction = 118
• 4. Reverse Transcription (RT) = 119
• 5. Polymerase Chain Reaction (PCR) = 119
• 6. Densitometry = 120
• 7. Immunohistochemistry = 120
• Ⅲ. Results = 123
• 1. Optimization of RT-PCR of p57^(kip2) = 123
• 2. p27^(kip1) and p57^(kip2) mRNA expression in mouse testis during postnatal development = 123
• 3. p57^(kip2) protein localization in mouse testis during postnatal development = 127
• 4. p57^(kip2) protein localization in adult human testis with various defects = 130
• Ⅳ. Discussion = 133
• Overall Discussion = 136
• References = 144
• 국문초록 = 169