Cobalt protoporphyrin induces THP-1 monocytic cell differentiation via Ref-1-mediated p47phox activation = Cobalt protoporphyrin의 인간 단핵구 세포주의 분화 유도 및 Ref-1 매개 p47phox 활성화의 관련성에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

Metalloporphyrin계 화합물인 cobalt protoporpyrin (CoPP)은 다양한 세포나 조직에서 효과적인 heme oxygenase-1 (HO-1)의 유도제로 널리 사용되고 있다. 본 논문에서 저자는 CoPP가 인간 단핵구 세포주 THP-1을 대식세포로 분화 유도함을 다양한 실험 방법을 이용하여 최초로 증명하고자 한다. 배양 중인 THP-1 세포에 CoPP의 처리는 세포의 성장 감소, 모양 변화, 부착능 증가, 그리고 세포 표면 유전자 (CD11b, MMP9, CD14) 발현의 증가와 같은 분화된 대식세포에서 보이는 특이성을 보였다. 그러나 hemin이나 ZnPP, SnPP와 같은 다른 protoporphyrin 물질은 THP-1 세포의 대식세포로의 분화를 유도하지 못 하였다. Iron chelator인 DFO는 CoPP에 의한 THP-1 세포의 분화유도를 저해하였는데, 이는 CoPP에 의한 THP-1 세포의 대식세포로의 분화과정에는 iron이 필요하다는 것을 의미한다. 또한, 단핵구의 대식세포로의 분화과정에서 세포내 산화환원계 (redox system)의 관련성을 알아보기 위하여 NADPH oxidase와 redox factor-1 (Ref-1)의 역할을 조사하였다. 흥미롭게도, CoPP 처리로 분화유도된 THP-1 세포는 분화가 진행됨에 따라 NADPH oxidase의 소단위인 p47phox가 축적되었고, 세포질에 존재하는 Ref-1은 점차적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 또한, NADPH oxidase의 저해제인 DPI는 CoPP에 의한 THP-1 세포의 분화유도를 억제하였다. 마지막으로, CoPP에 의한 분화과정에서 Ref-의 역할을 직접적으로 분석하기 위하여 Ref-1 siRNA를 사용하였다. Ref-1 siRNA로 세포내 Ref-1의 발현을 knockdown 시킨 경우, CoPP에 의한 p47phox의 발현이 증가하였고 또한, 대식세포로의 분화도 더 증가하는 결과를 가져왔다. 앞선 결과들을 종합하면, CoPP는 THP-1 단핵구 세포를 대식세포로 효과적으로 분화 유도시키며, 이 분화과정에는 세포질 Ref-1의 매개에 의한 NADPH oxidase의 활성화가 관여하고 있다는 것을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cobalt protoporphyrin (CoPP), a synthetic metalloporphyrin, is known to be a effective inducer of heme oxygenase-1 (HO-1) in many tissues. In this study, we report that CoPP induces differentiation of THP-1 human monocytic cells into macrophage-like cells. CoPP treatment resulted in differentiated phenotype, according to loss of proliferation, adherence, morphology, and expression of cell surface markers (CD11b, MMP9, and CD14). However, other protoporphyrins, hemin and ZnPP, did not influence morphology or the amount of adherent THP-1 cells. And, the iron chelator DFO inhibited the CoPP-induced differentiation of THP-1 cells. Importantly, we observed a gradual decrease of cytoplasmic redox factor-1 (Ref-1) accompanied by accumulation of p47phox during CoPP-induced differentiation. In addition, treatment of with Ref-1 siRNA or with NADPH oxidase inhibitor DPI enhanced and abolished the CoPP-induced differentiation, respectively. Based on these data, we conclude that CoPP-induced differentiation of THP-1 cells is associated with novel function of cytoplasmic Ref-1 and NADPH oxidase activity in an iron-dependent fashion.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 4
• 2.1 Reagents 4
• 2.2 Cell culture 4
• 2.3 Evaluation of cell proliferation 5
• 2.4 Adhesion assay 5
• 2.5 RT-PCR 6
• 2.6 Flow cytometry 6
• 2.7 Cytosol/nuclear protein extraction 7
• 2.8 Western blot analysis 8
• 2.9 Nile red staining 8
• 2.10 Transfection of small interfering RNA (siRNA) 9
• 2.11 Statistics of reproducibility 9
• 3. Results 10
• 3.1 CoPP changes cell proliferation, adherence, and morphology in THP-1 human monocytic cells 10
• 3.2 CoPP stimulates expression of differentiation markers in THP-1 cells 14
• 3.3 SnPP, ZnPP, and hemin do not stimulate the changes of adherence and morphology in THP-1 cells 18
• 3.4 Iron is required for CoPP-induced differentiation of THP-1 cells 22
• 3.5 Ref-1 and NADPH oxidase are associated with THP-1 cell differentiation by CoPP 25
• 4. Discussion 30
• 5. References 33
• 6. Abstract 39
• 7. 국문요약 40