CD81 신호전달에 의한 epstein-barr virus 변형 B 세포의 세포자멸사 기전 = Signaling mechanism of CD81-mediated apoptosis in epstein-barr virus transformed B cell

국문 초록 (Abstract)

목적 : Epstein Barr virus (EBV)가 감염된 B세포는 in vitro에서 불멸화를 겪어 암 세포주가 되는데 이러한 변형과정은 in vivo에서 바이러스 원인에 의해 발생하는 암의 생성과정과 유사하다. 기존의 EBV와 관련된 연구들은 B세포의 활성에 관련된 물질이 대부분인데, 아직 EBV 변형과정을 효과적으로 제어하는 물질은 밝혀져 있지 않다. 본 연구는 EBV 변형과정에서 발현이 증가하는 물질을 대상으로 EBV 변형과정을 제어 하는 물질 발굴에 대한 연구의 일환으로 세포표면 단백질인 CD81을 발굴하여 그 기능과 세포내 작용 기전을 밝히고자 하였다.
방법 : 사람의 혈액에서 B세포를 분리하여 EBV 감염 세포 배양액과 cyclosporin A를 첨가하여 EBV 감염을 유도하였다. EBV 감염 B세포가 4주 동안 변형과정을 겪으면서 세포 표면에서 CD81의 발현 변화를 유세포분석기와 공초점현미경을 통하여 확인하였다. 발현 변화 확인 후 항-CD81 항체와 합성한 C형 간염 바이러스 E2 단백질을 이용하여 CD81물질을 자극하였다. CD81 자극에 의한 EBV 변형 B 세포의 변화를 Alamablue assay와 유세포분석 기법을 이용하여 세포증식 반응의 변화와 세포자멸사 유무를 확인하였다. 이렇게 확인된 세포자멸사 유도의 기전을 밝히기 위해 활성산소 생성 유무와 caspase 관련 유무를 여러 억제제를 이용하여 반응의 변화를 관찰하였다.
결과 : 이미 B세포의 표면에 발현되어 있는 CD81이 EBV 감염에 의한 변형과정에서 3주까지는 세포표면 발현이 감소하였다가 4주째 변형에 의한 세포주 형성이 완료되면서 발현이 세포 표면에 증가되었다. EBV 변형 B 세포에서 발현이 증가한 CD81을 항-CD81 단클론항체와 CD81과 결합하여 세포내로 신호를 전달하는 것으로 알려진 C형 간염 바이러스 E2 단백질로 자극한 결과 세포증식반응은 억제되고 세포자멸사(apoptosis)가 유도되었다. CD81 자극은 먼저 세포 내 활성산소 생성을 유발하였고 이 유발된 활성산소는 사립체 세포막 붕괴를 일으켰고 이러한 사립체 세포막 붕괴에 따른 caspase 활성에 의해 EBV 변형 B세포의 세포자멸사가 유도 되었다.
결론 : 사람 B세포에서 EBV가 감염되어 세포주로 변형되는 과정에서 발현이 증가하는 CD81은 EBV 변형 B세포의 세포자멸사에 관여하여 증식을 조절하는 물질의 하나로 판단되었다. 이려한 결과는 CD81가 in vivo에서 EBV 관련 암의 소멸을 위한 치료적 연구에 중요한 역할을 할 것으로 추정할 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Objective : In vitro Epstein Barr virus (EBV) immortalizes primary B cells and generates B lymphoblastoid cell lines (LCLs). This process has many similarities with the carcinogenesis in vivo. In other many studies, it has been known that LCLs show high level of expression of the B-cell activation markers and cell adhesion molecules. The majortity of these molecules has a role for the proliferation of LCLs. In this study, we found that CD81 molecule was over-expressed on EBV transformed B cells. Further studies to identify the role of CD81 on EBV transformed B lymphoblastoid cell line are performed.
Materials and Methods : Purified B cells and B95-8 cell line were used for EBV infected B cells. The expression pattern of CD81 molecules during EBV transforming process was observed by flow cytometry and confocal microscopy. CD81 stimuli were performed with anti-CD81 antibody and Hepatitis C Virus E2 protein. Alama-blue assay and flow cytometric analysis were preformed to identify the role of CD81 on EBV transformed B cells. And to trace the mechanism of CD81 signaling, we tested intracellular reactive oxygen species production and caspase activity on EBV transformed B cells.
Results : The expression of CD81 was down-regulated until 3 weeks but CD81 expressed highly on EBV transformed B cells at 4 weeks. CD81 stimuli (with anti-CD81 mAb or Hepatitis C Virus E2 protein) inhibited proliferation and induced apoptosis of EBV transformed B cells. The CD81 engagement immediately produced reactive oxygen species, which subsequently disrupted mitochondrial membrane potential (Δψ). The disruption of Δψactivated caspase cascade, which eventually induced apoptosis of EBV transfromed B cells.
Conclusion : EBV transformation increased the expression CD81 molecules, CD81 stimuli induced apoptosis EBV transformed B cells. These results suggest that CD81 may be one of the molecules associated with apoptosis and regulation for proliferation and that CD81 may have the important role for the regulation of EBV associated lymphoma in vivo.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 연구목적 = 4
• Ⅲ. 연구재료 및 방법 = 5
• 가. B95-8 세포주를 이용한 EBV 감염배양액 제작 = 5
• 나. 전혈에서 순수 B세포의 분리 = 5
• 다. B세포의 확인과 EBV 감염 = 6
• 라. EBV 감염 유무 확인 = 7
• 마. 유세포분석을 통한 CD81의 발현 분석 = 7
• 바. 공초점현미경을 통한 CD81 발현 확인 = 8
• 사. 세포증식반응 분석 = 8
• 아. 세포자멸사(apoptosis)의 확인 = 9
• 자. 사립체 세포막전위(Δψ)와 활성산소(ROS) 측정 = 9
• 차. CD81 매개 세포자멸사 억제 실험 = 10
• 카. Antimycin A를 이용한 실험 = 10
• Ⅳ. 연구결과 = 11
• 가. B세포 순도 확인 및 EBV 감염 확인 = 11
• 나. EBV 감염에 의한 CD81의 발현변화 = 12
• 다. CD81 자극은 세포 증식반응 억제 = 16
• 라. CD81 자극은 세포자멸사(apoptosis) 유도 = 17
• 마. 사립체 막전위(Δψ) 붕괴와 활성산소 생산 = 19
• 바. CD81 자극은 caspase 활성 유도 = 21
• 사. Antimycin A(mitochondria complex Ⅲ inhibitor)에 의한 세포자멸사 억제 = 23
• Ⅴ. 고찰 = 25
• Ⅵ. 결론 = 29
• 참고문헌 = 30