Purification and Characterization of Extracellular Medium-Chain-Length Polyhydroxyalkanoate Depolymerase from a Marine bacterium, Pseudomonas pachastrellae M13-3

국문 초록 (Abstract)

본 실험에서는 MCL-PHA의 대체 기질로 lipase계열의 효소를 induction하는데 많이 사용되는 계면활성제 Tween20을 사용하여 Pseudomonas pachastrellae M13-3 균주의 MCL-PHA depolymerase를 생산하고 이를 정제하여 그 특성을 알아보았다.
먼저 해당 균주의 MCL-PHA 분해능을 알아보기 위해 단일 탄소원으로 MCL-PHA의 일종인 PHO가 포함된 고체배지에서 배양하였다. 그 결과 PHO 고체배지에서 colony주변으로 뚜렷한 halo가 형성된 것을 관찰하였고 해당 균주가 MCL-PHA 분해능을 가진 것으로 판단하였다. 16s rDNA분석을 통하여 Pseudomonas pachastrellae M13-3 균주로 동정되었다. 이 균주는 해양 미생물로, 기존에 연구되었던 균주들이 주로 토양 미생물이었다는 점과 구별된다. 다양한 농도의 Tween20아 단일 탄소원으로 포함된 배지에서 배양하였고, 기질을 4 g/L의 농도로 제공하였을 때 MCL-PHA depolymerase의 생산 효율이 가장 뛰어났다. 생산한 효소는 cell을 제거하고, 남은 상등액을 diafiltration 과정을 거쳐 농축하였다. 농축된 crude enzyme은 MCL-PHA depolymerase의 특성을 고려하여 DEAE column과 Octyl-Sephrose CL-4B column을 이용한 FPLC 기법으로 정제하였다. 정제결과, 약 28.4 kDa의 위치에서 단일 band를 확인하였고 activity staining을 통해 해당 band가 MCL-PHA depolymerase임을 확인하였다. 정제된 효소의 최적 활성조건은 pH 10.5, 50℃ 였는데, 이는 기존에 알려진 다른 MCL-PHA depolymerase 보다 높은 것으로 나타났다. pH가 효소의 안정성에 미치는 영향을 살펴보면, pH 9.0-11.0의 알칼리 범위에서 그 활성이 안정적으로 유지되었고, 산성범위의 pH나 극 염기성에서는 효소 활성이 저해되는 경향을 보였다. 온도에 따른 효소 안정성 실험에서는 모든 온도에서 시간이 지날수록 효소활성이 줄어들었고, 특히 60℃ 이상의 고온에서는 효소활성이 급격히 감소하였으며, 50℃이하의 온도에서는 3시간이 지나도 70 % 이상의 효소 활성이 나타나는 것을 알 수 있었다. 다양한 저해제와 금속 이온이 효소 활성에 미치는 영향을 살펴본 결과, sodium azide, acetic anhydride, PMSF와 여러 종류의 nonionic detergents에 의해 효소활성이 저해되었다. 이는 기존의 MCL-PHA depolymerase의 특징과 일치하는 결과이다. 또한 Co2+, Zn2+, Ni2+, Ag2+, Fe2+와 같은 금속이온들에 의해서도 효소활성이 저해되었다. 다른 효소들과 달리 EDTA에 의해 그 활성이 저해되지 않는다는 차이점을 보였다. 이는 해당 효소가 cofactor로 metal ion을 필요로 하는 metalloprotein이 아니라는 것을 의미한다. 기질특이성 실험에서, 정제된 효소는 MCL-PHA의 일종인 PHO를 분해할 수 있었고, SCL-PHA의 일종인 PHB와 합성 폴리에스터인 PCL, PLA는 분해할 수 없었다. 또한 PNP-alkanoates를 기질로 하여 알아본 esterase activity 측정결과, MCL PNP-alkanoate에 대한 효소활성이 SCL PNP-alkanoate에 대한 효소활성보다 뛰어난 것으로 나타났다. 이러한 특성을 바탕으로 본 균주가 생산하는 MCL-PHA depolymerase는 기존에 밝혀진 효소들과는 다른 새로운 종류의 MCL-PHA depolymerase로 판단된다.
현재까지 주로 토양 미생물이 분비하는 MCL-PHA depolymerase에 대한 연구가 진행되었으나, 본 연구에서는 해양 미생물이 분비하는 MCL-PHA depolymerase를 대상으로 하였으므로 MCL-PHA depolymerase의 다양성을 탐구하는 데에 더 다양한 정보를 제공할 것으로 보여진다.

목차 (Table of Contents)

• Introduction 1
• Materials and Methods 4
• 1. Preparation of the polymers suspension 4
• 2. Identification of the PHO degrader 4
• 3. Cultivation of the microorganism 4
• 4. Purification of the extracellular MCL-PHA depolymerase 5
• 4-1. Concentration of supernatant 5
• 4-2. Purification of phaZPpaM13-3 5
• 4-3. Gel electrophoresis analysis 5
• 5. Enzyme assay 6
• 5-1. MCL-PHA depolymerase activity 6
• 5-2. Esterase activity 6
• 6. Characterization of the enzyme 6
• 6-1. Effect of pH on the enzyme activity 7
• 6-2 Effect of temperature on the enzyme activity 7
• 6-3 Effect of temperature on the enzyme activity 7
• 6-4. Effect of metal ions on the enzyme activity 7
• 6-5. Substrate specificities of the enzyme 8
• Results and Discussion 9
• 1. Characteristics of the isolate 9
• 1-1. Identification of isolate 9
• 1-2. Effect of Tween 20 concentration on cell growth and enzyme production 9
• 2. Purification of the MCL-PHA depolymerase 14
• 3. Characterization of the enzyme 17
• 3-1. Effect of pH and temperature on the enzyme activity 17
• 3-2. Effect of inhibitors and metal ions on the enzyme activity 17
• 3-3. Substrate specificities of the enzyme 18
• Conclusion 27
• References 29
• 국문초록 32
• 감사의 글 34