마늘대 추출물(Allium sativum L. stem)의 유용성 약리검증 및 외관이 투명한 자외선 차단제에 관한 연구 = Study of the usefulness pharmacological verification of Allium sativum L. Stems extractions and Clear sunscreen emulsion

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In this study, in order to promote the use of galic by-products, the anti-oxidant, anti-inflammatory, whitening effects and antimicrobial activity of water extract, 70% ethanol extract of Allium sativum L. Stems (ASSW, ASSE) was investigated. and developed transparent sunscreen cosmetic which has waterproofing property and no white turbidity when applied to skin. Total phenolics were more present in ASSE(44.7±1.32) than ASSW(37.08±1.51). Electron donationg ability (EDA) and ABTS+ radical scavenging activity were evaluated ASSW(44.02%), ASSE(50.84%) and ASSW(96.86%), ASSE(97.79%) at 1,000 μg/mL, respectively. To examine the potential anti-inflammatory effects of ASSW, ASSE levels of nitric oxide (NO) and pro-inflammatory cytokines, such as interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), prostaglandin-E2 (PGE2) and cell proliferation were measured. The ASSW, ASSE at 100 μg/mL concentration showed inhibitory effect on NO production by 17.75% and 22.02%, respectively. ASSW and ASSE showed inhibitory effects on the expression of the PGE2 by 54.33%, 59.87% when treated at 100 μg/mL. Production of interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) were decreased by approximately over 15% upon ASSW, ASSE treatment (100 μg/mL). Allium sativum L. Stems extracts were tested for protein and mRNA of iNOS, COX-2 levels. These results suggest that ASSE has a suppressed production of many inflammatory mediators then ASSW by LPS. Allium sativum L. Stems extracts doesn’t inhibits pERK, pJNK, pp38. In this experiment, we know that ASSE is more effective than ASSW. so the solvent extracts(Hexan, Butanol, Ethyl acetate, Water) of Allium sativum L. Stems were investigated again for the activities of anti-oxidant and anti-inflammation. Ethyl acetate(ASSE-EA) showed the best effect at anti-oxidant among others. and then we have investigated decrease effects of ASSE-EA on protein levels of iNOS, COX-2. As a result iNOS, COX-2 indicated dose-dependently decrease 68.41%, 30.45% at 25 μg/mL, respectively. To confirm the skin-whitening effects of Allium sativum L. Stems, we did experiment such as tyrosinase, protein levels of tyrosinase, MITF, TRP-1 and TRP-2 on B16F10 melanoma cells. But, there was no suppression. antimicrobial activity also couldn’t show striking effects.
Measured the refractive index of water phase and oil phase to develop transparent sunscreen cosmetic. The transparent sunscreen is prepared by exploiting refractive index difference between oil-phase and water-phase of water-in-oil(W/O) emulsion. To make the same refractive index, we did control of polyol to raise refractive index in water phase and used the silicon oil for drop the refractive index of the oil-phase. SPF and PFA values of transparent sunscreen were indicated 30.99±1.65 and 3.01±0.30.

국문 초록 (Abstract)

마늘대 부산물을 활용하여 화장품 소재 및 식품 등으로 활용하기 위해 열수추출(ASSW)과 70% 에탄올 추출(ASSE)을 통해 얻어낸 추출물을 가지고 항산화능, 항염증, 미백, 항균 효과를 검증하였으며, 내수성을 지니고 사용 시 백탁현상이 없는 투명한 외관을 가지는 외관이 투명한 자외선 차단제를 개발하였다. 마늘대 추출물의 폴리페놀 함량을 측정한 결과 ASSW의 경우 37.08±1.51 ASSE의 경우 44.7±1.32의 함량을 나타내었다. 전자공여능(DPPH)을 측정한 결과 농도 의존적으로 증가하여 1,000 μg/mL에서 ASSW가 44.02%, ASSE가 50.84%의 저해능을 나타내었으며, ABTS cation radical 소거능은 1,000 μg/mL에서 ASSW 96.86% ASSE 97.79%의 높은 소거능을 나타내었다. RAW 264.7 cells에서 ASSW와 ASSE의 항염증 효과를 측정한 결과 Nitric oxide(NO)에서 control에 비해 100 μg/mL에서 ASSW의 경우 17.75%, ASSE의 경우 22.02%의 NO생성 저해률을 나타내었다. 염증을 유발시키는 Cytokines들을 측정한 결과 100 μg/mL에서 prostaglandin-E2 (PGE2)는 ASSW, ASSE에서 각각 54.53%, 59.87%의 저해률을 나타내었다. interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β)의 경우에도 100 μg/mL에서 15%이상의 저해율을 나타냈었다. RAW 264.7 세포에서 마늘대 추출물의 iNOS, COX-2의 protein, mRNA 발현량을 측정해본 결과 ASSW보다 ASSE의 경우에서 발현률이 줄어듦을 확인할 수 있었다. 또한 염증을 유발인자들의 생합성 기전을 알아보기 위해 pERK, pJNK, pp38을 측정해 본 결과 염증엑제률의 감소가 없었으며, 다른 경로를 통해 염증이 유발되는 것을 추측할 수 있었다. ASSW보다 ASSE에서 염증효과가 더 높았음을 확인한 후 ASSE에서 다시 층으로 극성별로 나누어 분획하여 실험을 진행하였다. 그중에서도 Ethyl acetate층이 다른 분획층에비해 항산화능이 높았음을 확인할 수 있었으며, 가장 낮은 NO생성률을 보여 Ethyl acetate층의 iNOS, COX-2의 protein발현률을 측정하였다. 그 결과 iNOS는 농도 의존적으로 줄어들어 25 μg/mL에서 68.41%의 저해률을 나타내었고 COX-2는 30.45%의 저해률을 확인할 수 있었다. 마늘대 추출물의 미백 효과를 확인하기 위해서 B16F10 cells에서의 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 protein 발현량을 측정한 결과 전체적으로 protein의 발현량을 억제해 주지 못하였으며 미백에 대한 효과는 미비한 것으로 확인되었다. 또한 마늘대 추출물의 항균효과 역시 기대한 것보다 효과가 전혀 나오지 않았음을 실험을 통해 확인하였다.
외관이 투명한 자외선 차단제형을 개발하기 위해 수상부와 유상부의 굴절률을 측정하였으며, 측정된 굴절률을 통해 수상부와 유상부의 굴절률을 동일하게 맞추어 외관을 투명하게 맞추었다. 수상부에서는 굴절률을 올려주기 위해 폴리올을 사용하여 굴절률을 조절하였으며, 유상부에는 굴절률을 낮춰주기 위해 실리콘계 오일을 사용하여 두 상의 굴절률을 동일시하게 맞추었다. 또한 제형의 안정성을 잡기위해 수상의 비율을 증가시킴으로써 내상증가로 인해 점도를 올리고 안정성을 잡았다. 자외선 차단 능은 SPF 30.99±1.65, PFA는 3.01±0.30의 자외선 차단 능을 확인하였다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 4
• 1. 실험재료 4
• 1) 재료 및 시료추출 4
• 2) 시약 및 기기 7
• (1) 항산화능 및 항염증 측정 시약 7
• (2) 미백효과 측정 시약 7
• (3) 세포 독성 측정에 사용된 세포주 및 시약 7
• (4) 항균력 측정에 사용된 균주 및 배지 8
• (5) Clear emulsion 제조시 사용된 원료 9
• (6) 실험에 사용된 기기 10
• 2. 실험 방법 11
• 1) 마늘대 추출물의 항산화 효과 측정 11
• (1) 총 폴리페놀 화합물 함량 측정 11
• (2) 전자공여능 측정 11
• (3) ABTS+ radical scavenging activity 측정 11
• 2) 세포 독성 측정 12
• (1) 세포 배양 12
• (2) MTT assay에 의한 세포 독성 확인 12
• (3) Nitric oxide 저해활성 측정 13
• 3) Pro-inflammatory cytokine 분비량 측정 13
• 4) Western blot을 통한 단백질 발현 측정 13
• 5) mRNA 분리 및 Real-time PCR 분석 15
• (1) Cell lysis 및 cDNA 합성 15
• (2) Real-time PCR 15
• 6) 항균효과 측정 16
• (1) 균 배양 16
• (2) 생육저해환(Clear Zone) 측정 17
• 7) 외관이 투명한 자외선 차단제 17
• (1) 굴절률 측정 17
• (2) 유중수형 유화액의 제조 18
• (3) 유상부와 수상부의 굴절률 차에 따른 투명성 측정 20
• (4) 유상부와 수상부의 비율 차이에 따른 안정도 측정 20
• Ⅲ. 결과 및 고찰 21
• 1. Allium sativum L. Stems의 항산화능 측정결과 21
• 1) Polyphenol 함량 측정 21
• 2) 전자공여능 확인 23
• 3) ABTS+ radical scavenging activity 25
• 2. Allium sativum L. Stems의 항염증 효과 측정 결과 27
• 1) Macrophage cell(RAW 264.7)의 세포 독성 확인 27
• 2) Nitric oxide 저해활성 측정 결과 29
• 3) PGE2와 cytokine 저해활성 측정 결과 31
• 4) Western blot을 통한 iNOS 및 COX-2 발현 억제 확인 36
• 5) Real-time PCR을 통한 iNOS 및 COX-2 발현 억제 확인 39
• 6) ERK, JNK, p38 생성 억제 효과 측정 결과 42
• 3. Allium sativum L. Stems의 미백 효과 측정 결과 47
• 1) Melanoma cell (B16F10)의 세포 독성 확인 47
• 2) Western blot을 통한 MITF, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase 발현 억제 49
• 4. Allium sativum L. Stems의 지방생성 효과 측정 결과 55
• 1) Stem cell (3T3-L1)의 세포 독성 확인 55
• 5. Allium sativum L. Stems의 항균 효과 측정 결과 57
• 1) 생육 저해환 (Clear Zone) 측정 57
• 6. Allium sativum L. Stems(70% EtOH) fraction 61
• 1) 마늘대 에탄올 추출물의 분획 61
• 7. Allium sativum L. Stems(70% EtOH) fraction 항산화 측정 결과 62
• 1) 전자공여능 측정 62
• 2) ABTS+ radical scavenging activity 측정 64
• 8. Allium sativum L. Stems(70% EtOH) fraction 항염증 측정 결과 66
• 1) Macrophage cells (RAW 264.7)의 생존률 확인 66
• 2) Macrophage cells (RAW 264.7)의 NO 생성률 확인 68
• 3) Western blot을 통한 iNOS 및 COX-2 발현 억제 확인 70
• 4. 마늘대 추출물을 함유한 외관이 투명한 자외선 차단제 72
• 1) 원료별 굴절률 측정 72
• 2) 굴절률 차이에 따른 투명성 측정 74
• 3) 유상부 수상부 비율 차이에 따른 안정도 측정 78
• 4) 투명 자외선 차단제의 PFA, SPF 측정 결과 83
• Ⅳ. 참고문헌 85
• 초 록 93
• Abstract 96