조직공학기법을 이용한 바이오치주인대 개발에 관한 연구 = Development of Bioartificial Periodontal Ligament using Tissue Engineering Technique

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Periodontal disease is a most serious oral disease developed in all age group of the whole world, and the object of the healing is a regeneration of the damage of tissues such as alveolar bone, periodontal ligament, cementum. Recently the bone graft and guided tissue regeneration (GTR) have been used for the reconstruction of periodontal tissues. I progressed this study using tissue engineering for regeneration of the alveolar bone and periodontal ligament. A lot of studies using periodontal ligament cells (PDLCs) have been reported, but dental pulp stem cells (DPSCs) that have less possibility of contamination at the primary culture is considered as a good cell source more and more, so I used DPSCs in this study.
DPSCs from the tooth are adult stem cells which can differentiate into various cells at the specialization environment. It may include scaffolds providing the extracellular matrix, and special differentiation medium containing growth factors, cytokines and appropriate mechanical stimulation to differentiate DPSCs into the cells of another tissue.
Also, a lot of DPSCs are necessary to be used in cell therapy, so the cells must be tremendously expanded in a short time. Therefore, I used some growth factors to promote proliferation of DPSCs, but lineage-specific differentiation condition is strongly necessary because of their multi-differentiation capacity into another cells such as osteoblast, chondrocyte, adipocyte during culture. So, I used basal medium (α-MEM) to proliferate DPSCs and made a osteogenic differentiation medium which consists of the basal medium and supplements, dexamethasone, β-glycerophosphate, and ascorbic acid to differentiate into osteoblasts.
Also, chemical factors and mechanical factors play an important role in cell proliferation or differentiation. Therefore, I considered not only chemical factors but also mechanical factors to differentiate DPSCs into osteoblasts.
In this study I tried to find the effect of mechanical stimulus on the differentiation of DPSCs into osteoblasts using a cell training bioreactor and flexwell system imposing cyclic mechanical strain whose parameters were 0.03 Hz, 5%, 8% strain or 0.2 Hz, 10% strain. As a result, DPSCs under cyclic strain showed more regularly oriented alignment and lower expression of CD90 and CD105 than control by microscopy and FACS analysis. In transcriptional level, type I collagen, type Ⅲ collagen, bone sialoprotein, osteocalcin, osteonectin, osteoprotegerin mRNA expressions of DPSCs under cyclic strain were higher than those of control. In that, it is thought that mechanical cyclic strain induced the loss of stemness of DPSCs, therefore improved the differentiation into osteoblasts..
In the experiment using scaffold, I made bio-scaffolds that can improve the differentiation into alveolar bone using BMP-2, hyaluronic acid and hydroxyapatite.
As a result, it is found that the bio-scaffold containing three components at appropriate concentration was superior to the other bio-scaffolds in alveolar bone regeneration.
In conclusion, DPSCs under optimal growth factors/cytokines and mechanical stimulation could differentiate into osteoblasts and also these cells with special bio-scaffold could reconstruct alveolar bone in vitro and in vivo. In the future, DPSCs and the bio-scaffold will be useful in the alveolar bone regeneration as well as ligament regeneration.

국문 초록 (Abstract)

치주질환은 전 세계인종의 전 연령층에 이환되는 가장 심각한 구강질환의 하나이며, 치주치료의 궁극적인 목표는 치조골, 치주인대, 백악질 등 파괴된 조직의 재생에 있다. 오늘날 대부분 치주조직의 재생을 위해서 골이식술과 치주조직유도 재생술이 시행되고 있는데, 본 연구에서는 조직공학적 기법을 이용하여 치조골과 치주인대 재건을 목표로 연구가 진행되었다. 주로 치주인대 세포를 이용한 연구가 많이 이루어져왔으나, 일차 배양시 훨씬 오염의 가능성이 적은 치수세포가 좋은 세포원으로써 점점 사용되어지고 있으며, 본 연구에서도 치수세포를 사용하였다.
치아 내에 존재하는 치수세포는 다양한 stem cell의 하나로서 특별한 배양 및 분화 환경에서 다양한 세포로 분화할 수 있는 가능성을 지니고 있으며, 치수세포를 원하는 조직의 세포로 분화유도하기 위해서는 인체와 유사한 배양환경을 제공하는 스캐폴드, 분화에 필요한 성장인자 및 싸이토카인 등이 첨가된 특정 분화배지의 확립, 그리고 인대세포 분화유도를 위한 최적화된 기계적인 자극(응력/변형)을 주는 생물반응기 등을 모두 만족시켜야 한다.
또한 치수세포를 조직공학 및 세포치료에 이용하기 위해서는 많은 수의 세포가 필요하므로 단시간에 대량 배양되어야 한다. 치수세포의 증식을 촉진하기 위해 성장인자 등을 이용할 수 있으나 배양도중 골, 연골, 지방 등 다른 조직의 세포로 분화되는 문제점이 있어 본 연구에서는 기본 배지를 사용하여 세포 증식을 하였으며, 분화 시에는 다양한 첨가 물질을 첨가하여 분화배지를 제조하여 사용하였다.
세포 배양 시 화학적 요소뿐만 아니라 기계적 요소 또한 세포 반응에 중요한 역할을 한다. 그러므로 치수세포를 치조골세포로 분화시키기 위해서 화학적 요소뿐만 아니라 기계적 요소 또한 고려해야 한다. 먼저 기계적 자극이 세포의 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 세포신축 훈련배양기를 이용한 결과 적정 분화배지 사용과 기계적 자극에서 치수세포의 분화에 효과적임을 확인하였다. 본 연구에서는 2차원 신축 훈련 배양기를 사용 시 0.03 Hz로 유사관련문헌들의 조건보다 낮은 주기 조건과 다양한 크기의 기계적 자극에서 치수세포의 증식과 골분화의 영향을 확인하였으며, 3차원 신축 훈련 배양기 사용 시에는 10%의 기계적 자극과 0.2 Hz의 주기에서 치수세포의 골분화능을 확인하였다. 다양한 assay방법과 골세포에 많이 발현하는 세포외기질인 제1형 콜라젠, 제 3형 콜라젠, 본시알로프로테인, 오스테오칼신, 오스테오넥틴, 오스테오프로테게린 등의 mRNA 발현 및 조직검사를 통하여 적절한 기계적 자극에서 치수세포의 증식과 골분화능이 향상됨을 확인하였다.
골분화에 있어서 다양한 골분화 유도 물질 및 성장인자들은 중요한 역할을 하며, 배지 첨가물로서 또는 스캐폴드에 함유되어 많이 사용되어지고 있다. 본 연구에서는 BMP-2와 히아론산. 하이드록시아파타이트를 이용하여 치조골 분화에 보다 효과적인 바이오 치주인대용 복합스캐폴드를 제조하였다. 각 물질들의 골분화능은 이미 많은 연구들에서 알려져 왔으며, 본 연구에서는 물질들의 골분화 적정 농도를 찾아 하나의 복합 스캐폴드를 만드는데 목적을 두었다.
이러한 결과들은 다른 조직 및 장기의 세포도 적절한 기계적 자극이 주어진다면 체외에서 좀 더 효과적인 분화를 유도할 수 있을 것으로 판단되며, 치수세포를 이용한 바이오 치주인대용 복합 스캐폴드는 치주조직의 치료에 유용하게 이용될 것이다.

목차 (Table of Contents)

• 1. 서 론 = 1
• 1-1. 연구 배경 = 1
• 1-2. 연구 목적 = 2
• 2. 이론적 배경 = 6
• 2-1. 조직공학 = 6
• 2-2. 치주구조 = 9
• 3. 실험 재료 및 방법 = 13
• 3-1. 치수 세포의 일차 배양 = 13
• 3-2. 세포신축 훈련배양기를 이용한 치수세포로부터 치조골 유도 평가 = 13
• 3-2-1. Flex well system을 이용한 치수 세포의 치조골 분화 유도 = 13
• 3-2-2. Bioreactor system을 이용한 치수 세포의 치조골 분화 유도 = 24
• 3-3. 바이오 치주인대용 복합스캐폴드 제조 = 27
• 3-3-1. 히아론산이 함유된 스폰지의 치조골 분화 효능 평가 = 27
• 3-3-2. 치조골 분화 유도에 있어서 히아론산의 농도 최적화 = 30
• 3-3-3. 치조골 분화 유도에 있어서 하이드록시아파타이트의 농도 최적 화 = 34
• 3-3-4. BMP-2가 함유된 3차원 스캐폴드의 골분화 효능 평가 = 37
• 3-3-5. 하이드록시아파타이트와 BMP-2가 함유된 스캐폴드의 치조골 분화능 평가 = 40
• 4. 결과 및 토론 = 44
• 4-1. 치수 세포의 일차 배양 = 44
• 4-2. 세포신축 훈련배양기를 이용한 치수세포로부터 치조골 유도 평가 = 44
• 4-2-1. Flex well system을 이용한 치수 세포의 치조골 분화 유도 = 44
• 4-2-2. Bioreactor system을 이용한 치수 세포의 치조골 분화 유도 = 56
• 4-3. 바이오 치주인대용 복합스캐폴드 제조 = 60
• 4-3-1. 히아론산이 함유된 스폰지의 치조골 분화 효능 평가 = 60
• 4-3-2. 치조골 분화 유도에 있어서 히아론산의 농도 최적화 = 63
• 4-3-3. 치조골 분화 유도에 있어서 하이드록시아파타이트의 농도 최적화 = 68
• 4-3-4. BMP-2가 함유된 3차원 스캐폴드의 골분화 효능 평가 = 73
• 4-3-5. 하이드록시아파타이트와 BMP-2가 함유된 스캐폴드의 치조골 분화능 평가 = 78
• 5. 결론 = 82
• 6. 참고문헌 = 84
• ABSTRACT = 89