The association between polymorphisms of BET family genes and survival outcomes of non small cell lung cancer: BRD3 rs2427964C>T is associated with survival outcome : BET 패밀리 유전자의 다형성과 비소세포폐암환자 임상결과 사이의 연관성 : BRD3 rs2427964 C>T는 생존률과 연관성을 가짐

국문 초록 (Abstract)

BET(Bromodomain and extraterminal domain) 단백질은 후성유전학적 변형을 확인하고 유전자의 발현을 조절하는 역할을 한다. BET 패밀리 유전자의 다형성과 폐암환자 예후의 연관성을 알아보는 연구을 하였다. BET 패밀리(BRD2, BRD3, BRD4) 3가지 유전자에서 77개의 단일염기다형성을 선정하였고, 이를 773명 비소세포폐암환자 (발굴연구 : 349명, 검증연구 : 424명)와의 연관성 분석을 하였다. 77개의 다형성 중 11개의 다형성이 발굴연구에서 생존률과 연관성을 보였고, 이 중 rs2506711C>T 만이 검증연구에서도 생존률과 연관성을 보였다. 생물정보학적 분석 결과 rs2506711C>T는 이질염색질에 존재해 기능성 다형성이 아닐 가능성이 높았다. rs2506711와 연관비평형이 높은 단일염기다형성 중 rs2427964C>T (D′ and r2 = 0.98) 가 BRD3의 프로모터 부위에 존재하여 기능성 다형성으로 예측하고 기능연구를 진행하였다. rs2427964C>T는 생존률 분석에서 rs2506711와 동일한 연관성을 보였다 (under a recessive model, HR = 1.70, 95% CI = 1.11 – 2.61, P = 0.02; HR = 1.97, 95% CI = 1.18 – 3.28, P = 0.01; and HR = 1.92, 95% CI = 1.39 – 2.65, P = 8.0 × 10-5). 생물정보학적 분석에서 rs2427964 부위에 SIN3A와 ETS1 전사인자가 결합한다는 ENCODE 자료를 기반으로 ChIP-qPCR 분석으로 확인 결과, H1299, A549 두 세포주 모두에서 SIN3A와 ETS1이 rs2427964 부위에 결합함을 확인하였다. BRD3 rs2427964의 대립유전자 별 프로모터 활성을 확인하기 위해 진행한 Dual luciferase 분석에서 rs2427964 T유전자형의 활성이 높았다. Emsa 분석에서 rs2427964 T유전자형에 비해 rs2427964 C유전자형에 전사인자가 더 많이 결합하는 것을 확인하였고, 이 전사인자 중에는 전사 억제제로 알려진 SIN3A도 있음을 Supershift 분석을 통해 알 수 있었다. siBRD3를 사용하여 폐암세포주에서 BRD3 유전자 발현을 억제하였고 이 후 실험들에 사용되였다. BRD3 유전자의 폐암에서의 역할을 규명하기 위해 암화과정과 관련된 TB, MTT, Transwell, Wound healing, Colony foramtion 분석을 진행하였다. 이 실험들에서 BRD3의 발현이 억제되면 폐암세포주들의 확산, 이동 및 생존능력이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 BRD3의 억제된 발현은 세포주기 G2/M기에 영향을 미치고 사멸하는 세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다. 위 실험의 결과로 rs2427964C>T는 폐암에서 비정상적인 BRD3 발현에 영향을 줄 수 있음을 보여주었고, 이는 초기 비소세포폐암 환자의 예후를 예측하는 유용한 마커가 될 수 있음을 시사합니다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: Bromodomain and extraterminal domain (BET) proteins are epigenetic readers that regulate gene expression. It was investigated whether polymorphisms in BET genes are associated with the clinical outcomes of lung cancer.
Methods: The associations between 77 polymorphisms in BET family genes and clinical outcomes were analyzed in 773 non-small cell lung cancer patients (349 and 424 patients in the discovery and validation cohorts, respectively).
Results: Of the 77 polymorphisms investigated, 11 were associated with overall or disease free survival with P value less than 0.05 in the discovery cohort. Among these 11 polymorphisms, only one variant (rs2506711C>T) was replicated with same direction as the discovery cohort, in the validation cohort. BRD3 rs2506711C>T is located in heterochromatin region, so rs2427964C>T located in BRD3 promoter region with a strong linkage disequilibrium (D′ and r2 = 0.98) was found. BRD3 rs2427964C>T was significantly associated with overall survival in the discovery, validation and combined analysis (under a recessive model, Hazard Ratio (HR) = 1.70, 95% Confidence Intervals (CI) = 1.11 – 2.61, P = 0.02; HR = 1.97, 95% CI = 1.18 – 3.28, P = 0.01; and HR = 1.92, 95% CI = 1.39 – 2.65, P = 8.0 × 10-5, respectively). The BRD3 rs2427964 T allele had higher promoter activity than the rs2427964 C allele in a luciferase assay. The rs2427964 C allele binds more strongly to transcriptional repressor SIN3A than rs2427964 T allele in the super-shift assay. Knockdown of BRD3 with BRD3 specific siRNA decreased proliferation, migration and viability of lung cancer cells. BRD3 silencing also induced G2/M cell cycle arrest and increased apoptosis rate. These results suggest that BRD3 rs2427964C>T increases BRD3 expression through increased promoter activity, which has been associated with a poor prognosis for lung cancer.
Conclusions: BRD3 rs2427964C>T was associated with a poor survival outcome in non-small cell lung cancer patients.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. ABSTRACT IN ENGLISH 1
• Ⅱ. INTRODUCTION 3
• Ⅲ. MATERIALS AND METHODS 6
• Ⅳ. RESULTS 16
• Ⅴ. DISCUSSION 44
• Ⅵ. REFERENCES 48
• Ⅶ. ABSTRACT IN KOREAN 51