RNA sequencing for characterization of living organisms = RNA sequencing 분석을 통한 생명체의 특성 분석

국문 초록 (Abstract)

RNA 분자는 생명체의 필수적인 요소로 간주되고 있으며, 특정 조건 하에 서 단일 세포 내의 RNA의 특성을 이해하는 것이 많은 연구들의 궁극적인 목표로 자리잡고 있다. 이러한 RNA를 분석하는 다양한 방법들은 분석의 효 율성과 가격을 낮추고자 끊임없이 발전하고 있다. 이 중에서 RNA 염기서열 분석법은 Illumina 회사의 분석 방법을 기반으로 1세대 분석법인 Sanger 염기 서열 분석법을 거쳐 발전한 분석법이며, 작물 또는 간암과 같은 다양한 조직 과 세포에서 전사체의 차이 및 암의 이질성, 바이오마커 탐색, 그리고 약재 내성을 연구하는 분야에 많이 사용되고 있다. 본 연구에서는 RNA 염기서열 분석법, 정량적 실시간 증폭 분석법 그리고 생명정보학 분석법을 사용하여 두 가지 다른 종류의 조직의 전사체를 탐사하고, 이들의 발현 패턴과 관련된 기능을 비교하였다. RNA 염기서열 분석법을 활용한 작물의 연구에서 비슷한 발현 패턴을 보이는 70% 이상의 유전자를 유전자변형 작물과 일반 작물의 비교에서 확인하였으며, 이들과 관련된 기능이 광합성과 ABC 운송자와 주로 연관되어 있다는 것을 확인하였다. 한편, 벼 작물은 섭취를 통한 에너지원으로써 많이 이용되고 있기 때문에 많은 벼 작물 연구에서 내포된 항영양인자 를 연구하는 것이 중요하게 간주되고 있다. 이러한 이유로, 20개의 항영양인 자와 관련된 유전자를 선별하여 이들의 발현 패턴을 실시간 증폭 분석법으 로 확인하였고, 일반 벼 작물과 대비하여 약간의 차이를 보이지만 유전자변 형 작물이 유전적으로 안전한 것을 확인하였다. RNA 염기서열 분석법과 생 명정보학 분석법을 이용한 간암 연구에서는 암 조직과 낮은 수준의 면역 침투력을 보이는 조직에서 세포 독성 T 세포와 면역 관문과 연관된 유전자들 의 발현이 낮아짐을 보이며 억제된 면역 반응을 확인하였다. 이러한 이유로, 간암 환자와 면역 치료 간의 관계를 확인하고자 본 시료 내에서 유전자의 발현 패턴을 조사하였다. 이 중에서 IMPDH2 유전자가 암 조직과 면역 침투 수준이 낮은 조직에서 유의하게 증가한 발현 패턴을 보이며 선별되었고, 이 를 단백질 수준과 TCGA-LIHC 데이터베이스를 통해서 추가로 검증을 하였다. IMPDH2는 유전자의 발현과 M1 대식세포와 CD8 T 세포를 포함한 항암 면역 반응 간에 음의 상관관계를 보였고, 연구를 통해 IMPDH2가 항암 면역 반응을 감소시킴으로써 암을 발전시킬 수 있는 것을 확인하였다. 결과적으로, 본 연구에서는 다양한 전사체 분석법을 활용함으로써 두 가지 서로 다른 시료 의 유전자 발현 패턴과 관련된 기능을 연구하고, 유전자변형 작물의 유전적 안전성을 평가하였으며, 간암에서 암 치료에 활용할 수 있는 가능성 있는 유전자를 제시하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Since RNA molecules are considered as essence of life for all living cells, understanding of the identity and abundance in one cell under a specific condition is ultimate goal of much research. Various methodological technologies for transcriptome analysis targeting diverse types of RNAs are continuously developed to lead the higher efficiency and lower cost of sequencing. Bulk RNA sequencing (RNA-seq) is one of the illumine-based sequencing method investigated through first-generation sequencing method called Sanger sequencing and has been widely used in various type of tissues or cells, such as crops and human cancer, for profiling the difference of transcriptomes and the cancer biomarkers, heterogeneity, and drug resistance. In this study, I performed transcriptomic analysis by using RNA-seq, quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR), and bioinformatic analysis to profile the transcripts inside two different types of samples, and to compare expression patterns and enriched functions. In analysis of crop plants by using RNA-seq, almost 70% of similar gene expression patterns were found between transgenic and non-transgenic rice, and enriched functions of DEGs were mainly associated with photosynthesis or ABC transporter. Meanwhile, rice is widely used as energy sources, thus, screening of anti-nutrients is important in rice research. In this reason, I performed gene expression study of twenty anti-nutrients associated genes by using qPCR and showed genetical safety of anti-nutrients in transgenic rice with a few differences. In analysis of liver cancer by using RNA-seq and bioinformatic analysis, suppressive immune response along with reduced expression of cytotoxic T cell and immune checkpoint response associated genes were found in tumors and low-level immune infiltration groups. To study the relationship between immunotherapy and HCC patients, I investigated reported immunotherapy-related genes and confirmed gene expression patterns in the samples. Inosine monophosphate dehydrogenase 2 (IMPDH2) was significantly selected showing increased expressions in tumors and low-level groups, and it further validated in protein levels and TCGA-LIHC database. IMPDH2 was showed the negative correlation between gene expression and anti-tumor immune response including M1 macrophage and CD8 T cells. In this reason, IMPDH2 could promote tumor progression by reducing anti-tumor immune response. In conclusion, by using various transcriptome analysis, I profiled gene expression patterns and enriched functions in rice and liver samples, assessed genetical safety of transgenic rice, and provided a potential therapeutic target gene in liver cancer.

목차 (Table of Contents)

• Korean abstract i
• Abstract iii
• Contents v
• List of Tables viii
• List of Figures ix
• Introduction 1
• References 5
• Part 1. Transcriptomic profiling and genetical safety assessment of transgenic rice
• Abstract 10
• I. Introduction 11
• II. Materials and Methods 13
• 1. Rice information and growth conditions 13
• 2. Total RNA extraction 13
• 3. RNA concentration and cDNA synthesis 15
• 4. Library construction, RNA sequencing, and bioinformatic analysis 15
• 5. Identification of Differentially Expressed Genes (DEGs) and functional enrichment analysis 15
• 6. Primer set of anti-nutrients biosynthesis-related genes 15
• 7. Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction (qPCR) 16
• III. Results 18
• 1. Quality of RNA sequencing and identification of DEGs in transgenic and non-transgenic rice 18
• 2. Functional enrichment analysis of non-transgenic and transgenic DEGs 21
• 3. Transcriptional assessment of the genes involved in anti-nutrients biosynthesis 24
• IV. Discussion 28
• V. References 30
• Part 2. Characterization of immune landscape in hepatocellular carcinoma based on RNA sequencing
• Abstract 34
• I. Introduction 35
• II. Materials and Methods 37
• 1. HCC tissue samples 37
• 2. RNA extraction .37
• 3. RNA sequencing 37
• 4. Identification of Differentially Expressed Genes (DEGs) and functional enrichment analysis 38
• 5. Western blot 38
• 6. The Cancer Genome Atlas (TCGA) database 39
• 7. Cell-type Identification using Estimating Relative Subsets of RNA Transcripts (CIBERSORT) 39
• 8. Estimation of Stromal and Immune cells in Malignant Tumor tissues using Expression (ESTIMATE) 39
• 9. Kaplan-Meier survival analysis 39
• 10. Statistical analysis 40
• III. Results 41
• 1. Characterization of tumor heterogeneity 41
• 2. Comparison of gene expression patterns between NT and T tissues 43
• 3. Comparison of gene expression patterns between T tissues with high or low immune cell infiltration scores 46
• 4. Elevated IMPDH2 expression was negatively correlated with anti-tumor immune cells 51
• IV. Discussion 57
• V. References 60
• Appendix 66