Coronary artery lesions development associated with blood IL-6 levels in patients with Kawasaki disease = 가와사키병 환자의 혈액 내 IL-6에 따른 관상동맥류 발달관계 규명

국문 초록 (Abstract)

가와사키병 환자의 혈액 내 IL-6에 따른 관상동맥류 발달관계 규명 정 지 혜 지도교수: 송 희 상 의과학과 조선대학교 대학원 급성 열성피부점막 림프절증후군으로도 알려진 가와사키병(Kawasaki disease, KD)은 일반적으로 5세 미만의 어린이 환자에게 발병하여 혈관에 염증이 생기는 급성 열성 혈관염으로 소아기 후천성 관상동맥 질환의 가장 주요한 원인이다. 가와사키병(KD)은 현재까지 5가지의 임상 진단이 알려져 있지만 아직까지 발병원인은 명확히 규명되지 않았다. 가장 심각한 합병증 또는 후유증은 Coronary artery aneurysm (CAA)와 같은 Coronary artery lesions (CAL)의 형성이며 현재 치료되지 않은 가와사키병 어린이의 약 20~25%에서 관상동맥 이상이 발생하는 것으로 알려져 있으며 이로 인해 장기 후유증이 발생할 수 있다. 급성 혈관 염증은 진행성 기능 장애, 혈소판의 광범위한 활성화 및 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell)의 탈분화를 특징으로 하며, 잠재적으로 병리적 혈관 리모델링 및 영구적 관상동맥 병리를 유발한다. 가와사키병(KD)의 병태생리에 중요한 역할을 한다고 알려진 전염증성 사이토카인의 종류 중 IL-6는 주로 대식세포와 림프구에서 생성되는 다면 발현성 사이토카인으로 죽상동맥경화증 및 관상동맥 재협착을 포함한 관상동맥 심장질환과 관련이 있다고 보고되어 있다. IL-6 수준은 동맥경화 및 고혈압을 포함한 심혈관 질환에서 증가하며 혈관 기능 및 구조의 변화를 촉진시키지만, 그러나 가와사키병 환자의 IL-6 조절에 의한 혈관평활근세포의(VSMC) 이동에 대한 기전 연구는 현재까지 알려진 바가 없다. 그러므로 본 연구에서는 IL-6 조절이 혈관평활근세포의 이동에 미치는 영향과 그 관련 기전을 통해 가와사키 질환의 혈액 내 IL-6 함량과 관상동맥류의 상관관계를 규명하고자 하였다. 먼저, 가와사키 질환을 가진 환자의 혈장을 이용하여 ELISA assay의 방식으로 혈액 내 IL-6의 함량에 대한 조사를 확인한 결과 건강한 어린이[Healthy control (HC group)] 대조군과 비교하였을 때 소아 KD환자 [Kawasaki disease (KD group) 및 관상동맥 병변이 있는 소아 KD환자 coronary artery lesion (KD+CAL group)]그룹의 IL- 6의 수치가 각 그룹별 상승한 것을 확인하였다. 혈관평활근세포(VSMC)의 이동성에서 그룹별 혈장 처리에 따른 영향 및 기전을 밝히고자 2D를 통하여 이동성 분석을 확인 해 본 결과, 정상그룹에 비해 KD 그룹, KD+CAL 그룹의 혈관평활근세포(VSMC)가 더 이동된 것을 확인하였으며, 마찬가지로 2D와 3D의 방식으로 IL-6의 농도별 처리를 하여 진행하였을 때 고농도에 따라 세포이동된 것을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 세포 이동의 지표인 MMP2, 9, 13의 발현 변화를 Western blot을 통해 확인한 결과, MMP2와 MMP9에서 유의적인 증가를 확인하였다. Zymography 분석을 통해 MMP2의 유의적인 증가를 추가로 보여줌으로써 IL-6 의한 혈관평활근세포(VSMC) 이동 증가 효과가 MMP2에 특이적이라는 것을 확인할 수 있었다. 이와 관련하여 Notch signaling pathway은 세포 간 통신 경로로써 혈관 발달 중 동맥 및 정맥 세포 운명을 결정하고, 혈관 형성 및 기존 혈관유지 등 조직의 안정성에 관여를 하는데, 이 중에서 Notch2의 역할 규명을 위해 Notch2의 활성을 저해시키는 siRNA를 처리하여 western blot을 통해 농도의존적으로 잘 발현되는 것을 확인한 바, 이후 결정된 농도를 실험에 사용하였다. 그 결과 48시간 동안 Notch2를 저해시키며 IL-6를 동시에 처리를 하고 난 후 MMP2,9의 발현이 대조군과 비교하였을 때 현저하게 감소되는 것을 확인하였다. 또한 다양한 사이토카인, 성장인자 등 다양한 생물학적 과정에서 신호 변환기 및 전사 요인으로서 세포의 다양한 기능에 관여한다고 잘 알려진 Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3)는 IL-6를 포함한 다양한 성장 인자 및 사이토카인에 반응하여 인산화가 유도된다는 논문들을 바탕으로 STAT3가 IL-6 및 Notch2 와도 연관이 있을 것이라 생각하였다. 따라서 본 연구에서는 Notch2가 증가한 혈관 혈관평활근세포(VSMC)의 이동에서 STAT3가 어떠한 역할을 하는지 알아보고자 하였다. 그 결과, VSMC에 IL-6 처리시 농도의존적으로 Notch2와 함께 STAT3의 현저한 증가를 확인하였고, 48시간 동안 Notch2를 저해시키며 IL-6를 동시에 처리하였을 때 p-STAT3 가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 IL-6를 처리한 혈관평활근세포(VSMC)에서 Akt, ERK, 및 p38 그리고 PI3K의 활성화를 알아보기 위해서 western blot을 진행한 결과 IL-6에 농도의존적으로 p38의 인산화 수준이 증가되는 것을 확인하였으나 Akt, ERK, PI3K의 변화는 확인할 수 없었다. 또한 p38, STAT3 억제제(SB239063, WP1066)는 혈관평활근세포(VSMC)에서 IL-6로 인해 증가된 이동을 감소시킬 수 있음을 확인하였으며, IL-6 처리에 의해 증가된 MMP2의 발현과 활성을 억제시켰다. 더불어 2D의 이동분석을 시행한 결과에서도 같은 경향을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과들을 통해, 본 연구에서는 IL-6 처리시 STAT3, Notch2, p38 신호전달 경로를 통해 MMP2의 발현 및 활성을 조절하여 혈관평활근세포(VSMC)의 이동을 유도한다는 것을 확인하였다. 이와 같이 IL-6에 의한 혈관평활근세포(VSMC)의 이동에서의 영향 및 그 조절 기전 규명을 통해, 가와사키 질환 내 높은 함량의 IL-6와 관상동맥류의 발달관계를 밝힘으로써, 이는 가와사키병(KD)의 조기 진단에 보조적 지표로 활용 가능한 근거를 제시할 수 있는 것으로 생각된다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 5
• 2.1. Blood samples from human patients 5
• 2.2. Cell culture 5
• 2.3. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 5
• 2.4. Cell migration assay 6
• 2.5. Transfection of siRNA 6
• 2.6. Western blotting 7
• 2.7. Gelatin zymography 7
• 2.8. Quantitative real-time PCR analysis 8
• 2.9. Statistical analysis 10
• 3. Results 11
• 3.1. KD and KD+CAL serum have higher levels of secreted IL-6 than HC 11
• 3.2. KD and KD+CAL serum promotes VSMC migration 13
• 3.3. Effect of IL-6 on VSMC migration 15
• 3.4. Effects of IL-6 on expression of MMP2/9/13 in VSMCs 17
• 3.5. Effect of Notch expression on IL-6-stimulated VSMCs 19
• 3.6. Silencing of Notch2 decreases the expression of MMP2/9/13 21
• 3.7. Silencing of Notch2 decreases VSMC migration 23
• 3.8. Silencing of Notch2 after IL-6-treatment results in decreased of STAT3 25
• 3.9. Effect of STAT3 inhibitors on IL-6-stimulated VSMCs 28
• 3.10. Effect of IL-6 on Akt, ERK, p38 and PI3K signaling pathway 30
• 3.11. Effects of p38, STAT3 inhibitors on expression of MMP2 induced by IL-6 32
• 3.12. Effects of p38, STAT3 inhibitors on expression of MMP2 by KD and KD+CAL serum treated VSMCs 34
• 3.13. Schematic diagram of IL-6 Increase VSMCs migration 37
• 4. Discussion 39
• 5. References 43
• 6. Acknowledgement 50