퇴비 메타게놈 라이브러리로부터 신규 Family VIII Alkaline Esterase의 클로닝 및 특성 분석 = Molecular Cloning and Characterization of Two Novel Family VIII Alkaline Esterases from a Compost Metagenomic Library

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

A metagenomic library was constructed from completely fermented compost. A total of 23,400 clones were obtained on LB plates supplemented with chloramphenicol. Using selective plates, 12 xylanase-, 5 cellulase-, 16 protease-, 2 α–amylase- and 19 esterase-positive clones were selected. Eighteen subclones were obtained by shotgun cloning of the restricted DNA from an induced mixed-culture of the esterase-positive clones. Two esterase genes, est2K and est7K, were isolated from esterase-positive subclones. The sequence analysis of the genes revealed that these esterase genes encoded proteins of 432 (44,668 Da) and 411 (45,038 Da) amino acids, repectively. These esterase genes had a SMTK motif and were family VIII esterase. Unlike most family VIII esterases, Est2K had a signal peptide of 27 amino acids. The amino acid sequence of Est2K showed 72% identity with that of EstC, an esterase of an uncultured bacterium from leachate and that of Est7K showed 65% identity with that of β-lactamase from Erythrobacter litoralis HTCC2594.
Est2K and Est7K were purified by High-Q, CHT-II, and HIC column chromatographies. The purified Est2K was about 44 kDa in molecular mass and was optimally active at 50℃ and pH 10.0. Est2K was stable in the presence of 30% methanol and exhibited a 2.4-fold higher activity in the presence of 5% methanol than in the presence of 1% isopropanol. The purified Est7K was about 42.4 kDa in molecular mass and was optimally active at 40℃ and pH 10.0. Est7K was exhibited a 2.1-fold higher activity in the presence of 30% methanol than in the presence of 1% isopropanol. Specific activity of the purified Est7K, 790.2 U/㎎ protein, was higher than that of the purified Est2K, 17.1 U/㎎ protein. Both esterases preferred short to medium length p-nitrophenyl esters, especially p-nitrophenyl butyrate, as the substrates. Both esterases did not hydrolyze β-lactam antibiotics ampicillin and nitrocefin, even though β-lactamase is the enzyme with the highest similarity to Est2K and Est7K in the family of VIII esterases. From these results, Est2K and Est7K could be used in biotechnological applications, especially, due to the fact that these enzymes are tolerant to methanol and active at alkaline condition.

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 큰 insert DNA를 완제품 퇴비로부터 얻어 Fosmid vector를 사용하여 metagenomic library를 제작하여 총 23,400개의 colony를 얻었다. 제한효소 분석 결과 삽입된 insert DNA의 크기는 35 kb 정도 였고, 이를 기준으로 대략 800 Mb의 metagenome DNA를 확보하였으며 이들로부터 유용한 효소를 생산하는 클론을 선별하였다. 선택배지를 통한 CMCase, xylanase, α-amylase, protease, esterase 활성클론의 선별을 수행한 결과 cellulase 5개, xylanase 12개, α-amylase 2개, protease 16개, esterase 19개를 확보하였다.
19개의 esterase 활성 클론을 혼합 배양하여 fosmid를 추출하고, 이를 shot-gun법으로 서브클로닝하여, esterase 유전자 est2K, est7K를 확보하였다. Est2K와 Est7K는 family VIII esterase가 가지는 SMTK의 motif를 가지고 있었으며, Est2K는 다른 family VIII esterase와 달리 signal peptide를 가지는 것을 확인하였다. Est2K는 토양의 uncultured bacterium의 esterase와 72%의 유사성을 나타내었으며, Est7K는 Erythrobacter litoralis HTCC2594의 β-lactamase와 65%의 유사성을 나타내었다.
Est2K와 Est7K는 High-Q, CHT-II와 HIC column chromatography로 정제되었으며, Est2K의 정제배수는 28.1, 회수율은 60.6%, Est7K의 정제배수는 67.5, 회수율은 15.2%로 나타났다. 정제된 Est2K는 50℃, pH 10.0에서 Est7K는 40℃, pH 10.0에서 최대 활성을 나타내는 alkaline esterases이었다.
Est2K는 30%의 methanol 존재 하에서 안정하였으며, 1%의 isopropanol이 존재했을 경우보다 5%의 methanol이 존재했을 경우 2.4배 이상의 높은 활성을 나타내었다. Est7K는 1%의 isopropanol이 존재했을 때보다 30%의 methanol이 존재했을 경우 2.1배의 높은 활성을 나타내었으며, 정제된 Est7K의 specific activity (790.2 U/㎎ protein)는 Est2K (17.1 U/㎎ protein) 보다 높았다. 두 esterase는 짧거나 중간 길이의 p-nitrophenyl esters에 특이성을 나타내었으며, 특히 p-nitrophenyl butyrate를 가장 잘 분해하였다. Family VIII에 속하는 두 esterase는 β-lactamase와 높은 상동 성을 보이지만 β-lactam 항생제인 ampicillin과 nitrocefin은 분해하지 못하였다. 이 두 효소의 methanol에 대한 내성과 알칼리성 조건의 반응 성 등으로 제약산업 및 생물공학적 응용에 유리하게 사용될 수 있을 것이다.

목차 (Table of Contents)

• I. 서론 1
• 1. Metagenome 1
• 2. 퇴비 6
• 3. Esterase 8
• 4. 연구목표 10
• II. 재료 및 방법 11
• 1. 퇴비 metagenome 확보 11
• 2. 퇴비 metagenomic library 제작 13
• 3. Metagenomic library로부터 유용유전자 선발 18
• 4. Esterase 유전자 서브클로닝 19
• 5. Sequence 분석 및 phylogenetic tree 작성 20
• 6. PCR에 의한 다른 활성 서브클론들의 증폭 21
• 7. Esterase 활성 측정 22
• 8. 효소의 정제 23
• 9. Esterase의 생화학적 특성 분석 24
• 10. Site-directed mutagenesis 26
• III. 결과 및 고찰 28
• 1. 퇴비 시료로부터 metagenome 추출 28
• 2. Metagenome DNA 준비 30
• 3. Metagenomic library 제작 32
• 4. Esterase 유전자 서브클로닝 35
• 5. Est2K의 특성 분석 37
• 6. Est7K의 특성 분석 52
• IV. 요약 65
• V. 참고문헌 67