톨유사 수용체 3 길항체에 대한 조류 선천적 면역 반응 관련 전사체 분석 = Transcriptomic analysis of avian innate immune responses to toll-like receptor 3 agonists

국문 초록 (Abstract)

조류 인플루엔자 바이러스 (AIV)는 인간을 포함한 많은 조류와 포유류에 영향을 주는 전염성 질병을 일으키는 병원체이다. 조류에서는 바이러스 및 기타 병원체에 대한 첫 번째 방어선인 선천적 면역계가 종마다 다르다. 이와 관련하여 닭은 AIV 감염에 매우 취약하지만 오리는 저항성이 있다. 오리와 닭에서 AIV의 병인을 이해하기 위해 많은 연구가 이루어졌다. 그러나 이 바이러스에 대한 새로운 치료법을 찾는 데에는 추가적인 연구가 필요하다.

4 개의 장으로 나누어진 이 박사 학위 논문은 오리와 닭의 숙주 바이러스 상호 작용에서 새로운 요소를 발견하는 데 중점을 두었다. 첫 번째 장은 선천적 면역 기능의 검토에 총력을 기울이고, 일반적으로 톨-유사 수용체 (TLR)의 역할, 특히 톨-유사 수용체 3 (TLR3)의 역할에 중점을 둔다. 그것은 TLR3 작용제에 대해 이야기하고 자극에 대한 선천적 면역 반응의 연구에 사용되는 현재 기술을 강조한다.

두 번째 장에서는 고 (H5N1) 및 저 (H2N3) 병원성 조류 인플루엔자 바이러스에 감염된 오리와 닭에서 숙주 바이러스 상호 작용에 관해 설명한다. 닭과 오리는 낮은 병원성 조류 인플루엔자 (LPAIV)와 높은 병원성 조류 인플루엔자(HPAIV)에 대해 다르게 반응한다. 이와 관련하여, LPAIV는 닭에서 가벼운 증상이 나타나고 오리에서 무증상 상태를 나타낸다. 그러나 HPAIV는 닭에서는 높은 사망률을 유발하지만 오리에서는 그렇지 않다. 닭과 오리의 AIV 병인에 대한 더 많은 통찰력을 얻기 위해, 우리는 차등적으로 발현된 유전자 (DEG)와 생물학적 기능을 확인했다. 이들 유전자는 상이한 유전자 온톨로지 (GO) 용어, KEGG 및 Reactome 경로와 연관되어있다. 오리에서, 리보솜 생합성 및 기능, RNA 대사 경로 및 넌센스 매개 감퇴 (NMD)와 관련된 몇몇 유전자는 HPAIV 및 LPAIV 감염으로 인해 하향 조절되었다. 그러나, 번역 제어, RNA 분해 및 전사 조절과 관련된 IGF2BP3, ZFP36L1, CNOT2 및 XRN1로 구성된 유전자 세트는 상향 조절되었다. 또한, 콜라겐 생합성, 형성 및 조립과 관련된 COL3A1, COL5A2, COL6A3, COL8A1 및 COL12A1로 구성된 또 다른 유전자 세트도 상향 조절되었다. 반면에, 많은 세포주기 관련 생물학적 과정, KEGG 및 Reactome 경로는 HPAIV 감염 닭에서 유의하게 풍부했다. 또한, 중요한 항 바이러스 유전자 인 IFI6은 하향 조절되었다. 이 유전자의 추가 분석은 NFκβ를 통한 TLR3 신호 전달 경로를 통해 발현됨을 나타냈다.

더욱이, 3장에서, DF-1 세포를 폴리 (I : C)로 자극하여 AIV와의 싸움에서 유용할 수 있는 신규 유전자를 검색 하였다. 결과적으로, 폴리 (I : C)는 강한 염증 반응을 유도하였으며, 여기서 IL-8, CCL4, CSF3 및 TNFSF15를 포함한 유전자는 고도로 상향 조절되었다. AIV를 포함한 바이러스에 대해 중요한 인터페론-자극 유전자 (ISG)의 일원 인 IFIT5 또한 강하게 상향 조절되었다. 유의하게 확인된 KEGG 경로는 선천적 면역 반응과 관련이 있었다. 이들 경로 중, 톨-및 RIG-1 유사 수용체 신호 전달 경로는 항바이러스 면역 반응과 관련이 있고 하나의 경로는 조류 A 인플루엔자 바이러스 감염과 관련이있었다. 또한, 폴리 (I : C)는 RUNX1에 의해 매개되는 Reactome 경로에서 myeloid 세포 분화의 양성 조절을 자극하였다.

이 연구들로부터, 오리의 AIV 감염에 대한 저항 뒤에 있을 수 있는 유전자가 확인되었으며 각 유전자의 역할을 확인하기위한 추가 연구의 대상이되어야한다. 그러나 닭에서, HPAIV- 감염 닭에서 많은 세포주기 관련 BP 용어 및 경로가 풍부해지고 중증도 및 높은 사망률과 연관될 수있다. 결국, DF-1 세포에서 폴리 (I: C)에 의해 유도된 유전자 중 일부는 AIV에 대해 항 바이러스 역할을하는 것으로 알려져있다. 전반적으로, 이러한 발견은 오리와 닭의 AIV 병인에 대한 현재의 이해를 더욱 증진시킬 것이며, 특히 닭에서 AIV에 대한 새로운 치료법을 찾는 데 유용할 수 있다.

목차 (Table of Contents)

• ASTRACT i
• Table of content
• List of tables viii
• List of figures x
• Abbreviations xv
• 1. GENERAL INTRODUCTION 1
• 2. LITTERATURE REVIEW 4
• 2.1. The innate immunity signalling` 4
• 2.1.1. Toll-like receptors and signalling mechanism 5
• 2.1.2. Tall-like receptor 3 and signalling mechanism 8
• 2.1.3. TLR3 agonists 8
• 2.2. Transcriptome Analysis 17
• 2.2.1. Technologies and methods for transcriptomics analysis 18
• 3. HOST-VIRUS INTERACTIONS IN DUCKS AND CHICKENS INFECTED WITH HIGHLY (H5N1) AND LOW (H2N3) PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA VIRUS. 21
• 3.1. Abstract 22
• 3.2. Introduction 24
• 3.3. Materials and methods 26
• 3.3.1. Microarray Data Acquisition and Gene Expression Profiling 26
• 3.3.2. Identification and Functional Analysis of Differentially Expressed Genes (DEGs) 28
• 3.3.3. Molecular characterization of target gene 28
• 3.3.4. Cell culture and induction with poly (I:C) and transcription factor inhibitor BAY 29
• 3.3.5. Total RNA extraction and cDNA synthesis 31
• 3.3.6. Quantitative Real Time RT-qPCR 32
• 3.3.7. Statistical analysis 32
• 3.4. Results 33
• 3.4.1. Identification of Differentially Expressed Genes 33
• 3.4.2. Gene Ontology (GO) analysis 42
• 3.4.3. REACTOME pathway analysis 59
• 3.4.4. Expression analysis of target DEGs from AIV infected chickens treated with poly (I:C) 62
• 3.4.5. Molecular characterization and expression analysis of a novel gene IFI6 65
• 3.5. Discussion 73
• 3.5.1. Expression analysis of a novel gene IFI6 78
• 4. TRANSCRIPTOMIC ANALYSIS OF CHICKEN FIBROBLAST DF-1 CELL LINES UNDER POLY(I:C) STIMULATION 80
• 4.1. Abstract 81
• 4.2. Introduction 83
• 4.3. Materials and methods 86
• 4.3.1. Cell culture and induction with poly (I:C) 86
• 3.3.2. Total RNA extraction 86
• 4.3.3. cDNA library preparation and RNA sequencing 87
• 4.3.4. Differentially expressed genes analysis 88
• 4.3.5. Functional enrichment and pathways analysis 88
• 4.3.6. Quantitative Real Time RT-qPCR 89
• 4.4. Results 91
• 4.4.1. RNA sequence results 91
• 4.4.2. Differentially expressed genes identification upon TLR3 poly (I:C) stimulation 91
• 3.4.3. Gene Ontology (GO) and KEGG pathway analysis 107
• 4.4.4. Immune system process 107
• 4.4.5. REACTOME pathways analysis 120
• 4.4.6. Validation of DEGs with RT-qPCR 121
• 4.5. Discussion 127
• 5: GENERAL CONCLUSION 133
• References 136
• 국문 초룩 158
• Acknowledgement 160