된장에서 분리된 Leuconostoc mesenteroides 유래 β-glucosidase의 클로닝 및 특성 규명 = Cloning and Characterization of β-Glucosidase from Leuconostoc mesenteroides Isolated from Doenjang

국문 초록 (Abstract)

한국 전통 발효식품인 된장으로부터 β-glucosidase를 생산하는 유산균을 분리하고자 esculin을 기질로 사용한 고체배지 상에서 명확한 효소활성을 보이는 균주를 분리하였고, 분리한 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석한 결과 본 균주는 Leuconostoc mesenteroides (GenBank OK513090.1)와 가장 높은 상동성을 보여 L. mesenteroides BDNA21으로 명명하였다. L. mesenteroides 유래 β-glucosidase는 클로닝 되어 15%의 수율과 14의 purification fold로 가용성의 단일 효소로 정제되었고, SDS-PAGE와 gel-filtration 크로마토그래피에 의해 동종이량체인 것으로 확인되었다. L. mesenteroides 유래 재조합 β-glucosidase의 최적 pH 및 온도는 각각 pH 6.0과 40℃였으며, 최적온도였던 40℃에서 오직 30분 동안에 50%로 잔존효소활성이 감소하는 열 안정성을 보였다. 그럼에도 불구하고 85%의 상대활성을 보였던 35℃에서는 4시간의 반감기를 나타내어 높은 열 안정성을 보였다. 기질특이성 검토에 있어서는 pNP-β-D-glucopyranoside에서 가장 높은 효소 비활성을 나타내었으며, pNP-β-D-fucopyranoside, pNP-β-D-galactopyranoside, oNP-β-D-glucopyranoside, oNP-β-D-galactopyranoside, pNP-α-L-arabinopyranoside, pNP-β-D-xylopyranoside, oNP-β-D-xylopyranoside와 같은 기질에도 가수분해 활성을 나타낸 반면, pNP-α-D-glucopyranoside, pNP- α-D-galactopyranoside, pNP-α-L-arabinofuranoside에는 활성을 보이지 않았다. L. mesenteroides 유래 β-glucosidase는 β-1,2 결합 보다는 β-1,4 결합에 가수분해 활성이 더 높은 것으로 검토되었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

β-Glucosidase producing microorganism was isolated from Doenjang due to its ability of forming black zone on esculin MRS agar plate containing esculin with ferric ammonium citrate. In the analysis of 16S rRNA gene sequence, this strain showed 99% of identity with Leuconostoc mesenteroides (GenBank OK513090.1). A recombinant β-glucosidase from L. mesenteroides was cloned and expressed in Escherichia coli BL21, and the enzyme was purified as a soluble protein with a 14-fold of purification and a final yield of 15%. The recombinant β-glucosidase was determined to be a homodimer by analyses of SDS-PAGE and gel-filtration chromatography. Optimum pH and temperature of β-glucosidase from L. mesenteroides was pH 6.0 and 40℃, respectively. At the optimum temperature of 40℃, the residual enzyme activity decreased to 50% in only 30 min. Nevertheless, it showed a high thermal stability with a half-life of 4 h at 35℃, where a relative activity of 85% was shown. In the substrate specificity study, specific activity was the highest for pNP-β-D-glucopyranoside, and the enzyme showed hydrolytic activity for substrates such as pNP-β-D-fucopyranoside, pNP-β-D-galactopyranoside, oNP-β-D-glucopyranoside, oNP-β-D-galactopyranoside, pNP-α-L-arabinopyranoside, pNP-β-D-xylopyranoside, and oNP-β-D-xylopyranoside. On the other hand, the enzyme showed no activity for pNP-α-D-glucopyranoside, pNP-α-D-galactopyranoside, pNP-α-L-arabinofuranoside. β-Glucosidase from L. mesenteroides had a higher hydrolytic activity on β-1,4 glycosidic linkage than on β-1,2 linkage.