재조합 균주 Escherichia coli가 생산하는 Bacillus stearothermophilus Acetyl Xylan Esterase의 정제 및 특성 = Purification and Characterization of Acetyl Xylan Esterase from Escherichia coli Cells Harboring the Recombinant Plasmid pKMG6

국문 초록 (Abstract)

Bacillus stearothermophilus의 acetyl xylan esterase 유전자를 pBR322에 크로닝하여 얻은 재조합 프라스미드를 가진 E. coli HB101/pKMG6 균주에 의한 esterase 생산 최적 배지 조성을 조사, 탄소원으로 0.5% acetylated birchwood xylan, 질소원으로 1% yeast extract를 사용했을 때 최대량의 효소 생산효과를 얻었다. 또한 상기 배지에서 다량의 효소를 생산하고 생산 효소를 ammonium sulfate 분획, DEAE Sepharose CL-6B column chromatography 및 Sephacryl S-200 gel filtration 등의 과정을 거쳐 단일 단백질로 정제하였다. 정제 esterase는 45℃ ; pH 6.5에서 가장 높은 효소 활성을 보였으며 1 mM Ag^(++), Cu^(++), Hg^(-+) 등에 의해 거의 완전한 실활을 나타내었으며 촉매 활성을 위해 어떤 특별한 금속 이온을 요구하지 않는 것으로 분석되었다. 또한 본 효소의 분자량은 gel 여과법으로는 약 60,000 dal, SDS-polyacrylamide gel 전기 영동법으로는 약 29,0000 dal으로 측정됨으로써 본 효소는 동일 subunit로 구성된 dimer인 것으로 밝혀졌으며 N-말단 아미노산 서열은 Ala-X-Leu-Gln-Ile-Gln-Phe-X-X-Gln으로 결정되었다. 한편 본 esterase는 ρ-nitrophenyl propionate, ρ-nitrophenyl butyrate 및 ρ-nitrophenyl valerate 등의 기질에는 잘 작용하지 않으나 acetyl xylan, α-naphtyl acetate, β-D-glucose pentaacetate, ρ-nitrophenyl acetate 및 MAS 등에는 매우 높은 활성을 나타내었다. MAS 기질에 대한 Km 값은 2.87 mM, Vmax 값은 11.55 μ㏖/min으로 측정되었다. 그리고 acetyl xylan 기질을 본 esterase로 전처리한 다음 xylanase로 가수분해시켰을 때 뚜렷한 상승 효과를 관찰함으로써 본 esterase가 일종의 acetyl xylan esterase 임을 확인할 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Acetyl xylan esterase was produced by E. coli HB101 harboring a recombinant plasmid pKMG6 which contained the estI gene of Bacillus stearothermophilus. The maximum production was observed when the E. coli strain was grown at 37℃ for 12 hours in the medium containing 0.5% acetyl xylan, 1.0% tryptons, 1.0% sodium chloride, and 0.5% yeast extract. The esterase produced was purified to homogeneity using a combination of ammonium sulfate fractionation, DEAE Sepharose CL-6B ion exchange chromatography and Sephacryl S-200 gel filration. The native enzyme had an apparent molecular mass of 60 kd and was composed of two identical subunits of 29 kd. The N-terminal amino acid sequence of the polypeptide was Ala-X-Ley-Gln-Ile-Gln-Phe-X-X-Gln. The acetyl esterase displayed a pH optimum of 6.5 and a temperature optimum of 45℃. The heavy metal ions such as Ag^(++), Hg^(++) and Cu^(++) inhibited nearly completely the activity of the esterase, and no specific metal ion was found to be required for the enzyme activity. The enzyme readily cleaved MAS, β-D-glucose pentaacetate, α-naphtyl acetate, ρ-nitrophenyl acetate as well as acetyl xylan, but hd no activity on ρ-nitrophenyl propionate, β-nitrophenyl butyrate or β-nitrophenyl valerate. The Km and Vmax values for MAS were 2.87 mM and 11.55 μ㏖/min, respectively. Synergistic behavior was demonstrated with a combination of xylanase and esterase from B. stearothermophilus in hydrolyzing acetyl xylan.