산양삼의 고환조직에 대한 항산화 및 항세포사멸 작용기전 : Testicular Antioxidant and Anti-Apoptosis Mechanisms of Cultivated Wild Ginseng

국문 초록 (Abstract)

남성의 정자수의 감소와 불임의 연관성은 이미 잘 알려진 사실이며, 근래에는 환경호르몬의 영향으로 정자수의 감소와 불임의 증가라는 악순환이 나타나고 있다. 또한 인구감소에 대한 우려와 더불어 아이를 갖고자 하는 부부에게는 불임으로 인한 정신적, 신체적, 경제적 부담이 커다란 사회적인 문제로 인식되고 있다. 산양삼은 유효성분의 종류가 다양하고 함량도 풍부하여 다방면에서 뛰어난 약리학적 효능을 가지고 있다. 지금까지 산삼의 주요 사포닌 분석은 주로 HPLC의 UV 검출기에 의한 검출이 많았지만, 낮은 분석파장에 의하여 검출 감도가 떨어지기 때문에 정확한 분석이 어려웠다. CAD (Charged aerosol detector)는 높은 감도와 낮은 검출한계를 제공하여 사포닌을 분석함에 있어서 매우 적합한 검출기임에 반해 연구가 많이 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 먼저 산양삼 추출물을 CAD를 이용하여 사포닌 성분을 분석 한 후, 환경호르몬에 의해 유도된 고환독성에 대한 산양삼추출물의 항산화와 anti-apoptosis기전에 대하여 세포와 동물모델을 이용하여 검증하고자 하였다.
우선, 산양삼 추출물을 분석한 결과, PPT계열 성분(Re, Rf, Rg1, Rh1)의 PPD계열성분(Rb1, Rd)보다 약 6배 정도 높은 함량을 보였다. 사포닌 유효성분과 산양삼추출물의 항산화활성을 Bisphenol A (BPA)로 유발된 고환세포주로 확인한 결과, BPA에 의해 감소한 항산화효소[superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT)]의 활성이 산양삼 추출물 및 Rg1에 의하여 증가하였으며, SOD, CAT, glutathione peroxidase (Gpx)의 발현도 증가하였다. 작용기전을 분석하기 위해 각 신호 전달물질들의 선택적 저해제를 처리한 결과, ERK, p38의 선택적 저해에 의해 SOD, CAT의 활성이 저해되는 것을 확인 할 수 있었다. BPA 투여로 고환독성이 유도된 SD-rat에서 산양삼추출물의 항산화 효과에 미치는 영향을 조사한 결과, SOD, CAT의 활성과 SOD, CAT, Gpx의 발현이 산양삼 추출물 투여에 의해 회복되는 것으로 확인되었다. 이는 고환조직의 조직학적 검경결과와 일치하였다.
마지막으로 산양삼 추출물의 고환독성에 대한 anti-apoptosis효과를 확인한 결과, 고환조직세포에서 분비되는 테스토스테론과 프로게스테론이 BPA에 의해 감소하였지만, 산양삼 추출물 및 Rg1에 의하여 증가하였다. 또한 pro-apoptotic 인자인 Fas, Capase3, Bax의 발현이 BPA에 의하여 증가하였고, anti-apoptotic 인자인 Bcl-2의 발현은 BPA에 의하여 감소하였지만, 산양삼 추출물 및 Rg1에 의하여 발현양상이 반대로 나타났다. 작용기전을 분석하기 위해 각 신호 전달물질들의 선택적 저해제를 처리한 결과, ERK, p38의 선택적 저해에 의해 Caspase3, Bax, Bcl-2의 활성이 저해되는 것을 확인 할 수 있었다. 동물실험에서는 BPA 투여로 고환독성이 유도된 SD-rat에서 산양삼추출물의 anti-apoptosis 효과에 미치는 영향을 조사한 결과, 혈청내의 테스토스테론, LH, FSH의 함량이 BPA에 의하여 감소하였지만, 산양삼 추출물 투여에 의하여 회복된 것을 확인 할 수 있었으며, 고환조직 단백질에서 Fas, Caspase3, Bax 및 Bcl-2의 발현이 세포모델과 같은 결과를 나타내었다. 또한 고환조직의 TUNEL assay실험을 통하여 고환조직의 apoptotic body를 관찰한 결과, BPA투여에 의하여 증가된 apoptotic body수가 산양삼 추출물 투여에 의하여 감소한 것을 확인 할 수 있었다. 그리고 부고환 내의 정자수를 비교한 결과, BPA에 의하여 감소한 정자수가 산양삼 추출물에 의하여 회복된 것도 확인 할 수 있었다.
이상의 결과를 종합해 보면, 산양삼추출물은 in vitro와 in vivo 연구에서 항산화, anti-apoptosis 효과를 가지는 것으로 사료되며, 이의 분자적 기전인 MAPKs 신호전달물질을 통한 세포독성 방어기전 물질로서의 활용이 크게 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• List of Figures i
• List of Tables v
• List of Abbreviation vi
• I. INTRODUCTION 1
• 1. Infertility 1
• 2. Endocrine-disrupting chemicals 2
• 2.1. Bisphenol A 4
• 3. Cellular defence mechanisms in Testes 4
• 3.1 Testicular antioxidant mechanism 4
• 3.2. Testicular apoptosis mechanism 8
• 4. Hormone & Spermatogenesis 9
• 5. Cultivated Wild Ginseng 12
• 6. Ginsenosides analysis 16
• II. OBJECTIVE OF THE STUDY 18
• III. MATERIALS AND METHODS 19
• PART I. Analysis of Ginsenosides in Cultivated Wild Ginseng 19
• 1. Chemicals 19
• 2. Cultivated wild ginseng extracts preparation 19
• 3. LC/CAD analysis 20
• PART II. Testicular Antioxidant Mechanism of Cultivated Wild Ginseng 21
• 1. In vitro study 21
• 1.1. Reagents and chemicals 21
• 1.2. Cell culture 22
• 1.3. Cell viability assay 22
• 1.4. Preparation of whole cell extracts 23
• 1.5. Assessment of ROS production 23
• 1.6. Assessment of antioxidant enzyme activities 24
• 1.7. Western blot analysis 25
• 1.8. Statistical analysis 26
• 2. In vivo study 26
• 2.1. Animals and chemicals 26
• 2.2. Animal experimental designs 27
• 2.3. Assessment of antioxidant enzymes activities in testes 29
• 2.4. Western blot analysis 30
• 2.5. Histopathological observation 30
• 2.6. Statistical Analysis 30
• PART III. Testicular Anti-Apoptosis Mechanism of Cultivated Wild Ginseng 31
• 1. In vitro study 31
• 1.1. Reagents and chemicals 31
• 1.2. Cell culture 32
• 1.3. Preparation of whole cell extracts 32
• 1.4. Hormone levels assay 32
• 1.5. Western blot analysis 33
• 1.6. Statistical analysis 34
• 2. In vivo study 34
• 2.1. Animals and chemicals 34
• 2.2. Animal experimental designs 35
• 2.3. Hormone levels assay 36
• 2.4. Western blot analysis 36
• 2.5. Terminal dUTP nick-end labeling (TUNEL) assay 36
• 2.6. Sperm cell counts in epididymis 37
• 2.7. Statistical Analysis 37
• IV. RESULTS AND DISCUSSION 39
• PART I. Analysis of Ginsenosides in Cultivated Wild Ginseng 39
• 1. Ginsenoside content of cultivated wild ginseng extract 39
• PART II. Testicular Antioxidant Mechanism of Cultivated Wild Ginseng 41
• 1. In vitro study 41
• 1.1. Cell viability 41
• 1.2. ROS production in BPA-treated TM3 Leydig and TM4 Sertoli cells 45
• 1.3. Testicular antioxidant enzyme activities in BPA-treated TM3 Leydig and TM4 Sertoli cells 49
• 1.4. Testicular antioxidant enzyme expression in BPA-treated TM3 Leydig and TM4 Sertoli cells 54
• 1.5. Phosphorylation of upstream kinases in BPA-treated TM3 Leydig and TM4 Sertoli cells 57
• 2. In vivo study 63
• 2.1. Body and testes weight of BPA-induced rats 63
• 2.2. Testicular antioxidant enzymes activities in BPA-induced rats 63
• 2.3. Testicular antioxidant enzyme expression in BPA-induced rats 66
• 2.4. Phosphorylation of upstream kinases in BPA-induced rats 68
• 2.5. Histopathological changes of testes in BPA-induced rats 68
• PART III. Testicular Anti-Apoptosis Mechanism of Cultivated Wild Ginseng 71
• 1. In vitro study 71
• 1.1. Hormone levels 71
• 1.2. Testicular apoptosis enzyme expression in BPA-treated TM3 Leydig and TM4 Sertoli cells 74
• 1.3. Phosphorylation of upstream kinases in BPA-treated TM3 Leydig and TM4 Sertoli cells 80
• 2. In vivo study 83
• 2.1. Hormone levels 83
• 2.2. Testicular apoptosis and anti-apoptosis enzymes expression in BPA-induced rats 85
• 2.3. Terminal dUTP nick-end labeling (TUNEL) assay 87
• 2.4. Sperm cell counts in epididymis 87
• V. CONCLUSION 90
• VI. REFERENCES 92
• Abstract 107
• 국문초록 110