Transgene Stability and Karyotype Analysis of CMV-resistant Transgenic Hot Peppers

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Many genetically modified crops were developed but the genetic instability of the introduced gene came to be a big problem to be solved for application of the transgenic plants. The existence and expression stability of transgene in CMVP0-CP introduced transgenic Hot peppers was investigated with two lines, H15 and B20. Genomic DNAs, total RNAs and total proteins extracted from leaf, flower and fruit tissues of non-transgenic and transgenic plants of T4 generation were analyzed by PCR, southern blot, RT-PCR, and western blot techniques. The transgenes were confirmed to exist stably during the generation, and transcription and translation of the gene was detected constantly in transgenic plant of two lines. It seems that the existence and expression stability of the introduced gene in CMVP0-CP transgenic Hot peppers keeps up during the generation. Karyotypes of transgenic Hot peppers were compared with those of non-transgenic plants using mitotic metaphase chromosomes. The somatic chromosome compositions of both transgenic and non-transgenic plants were diploids of 2n=24 and no significant difference in mitotic karyotypes considering chromosome length, type, and satellites etc., was observed between transgenic plants and non-transgenic plants.

국문 초록 (Abstract)

최근 여러 목적으로 형질전환체 식물이 다양하게 개발되고있다. 그러나, 형질전환체 식물에서 도입 유전자의 불활성화 현상이 종종 일어나 형질전환작물 개발의 문제점로 대두되고 있다. 따라서, 본 연구는 CMV 저항성 형질전환 고추 2 계통의 핵형분석과 도입유전자의 발현 안정성 분석을 실시하였다.
CMV 저항성 형질전환 고추 2 계통 H15와 B20의 잎, 꽃 그리고 열매를 이용하여 DNA, RNA 그리고 protein을 추출하여 PCR, southern blot, RT-PCR, western blot의 분자생물학적 방법을 통한 도입유전자의 존재 확인 및 발현안정성을 분석하였다. PCR 결과, 2계통 모두 1054 bp의 35S promoter 와 CMVP0-CP, 654 bp의 CMVP0-CP, 443 bp의 NPTⅡ band가 조사한 모든 식물체 부위에서 검출되었다. CMVP0-CP probe와 NPTⅡ probe를 사용하여 southern blot을 수행한 결과 형질전환 2 계통 모두에서 single band를 나타내어 single copy임을 확인 할 수 있었다.
또한. RT-PCR을 이용하여 CMVP0-CP의 654 bp와 NPTⅡ의 443 bp의 band를 2계통 모두에서 확인하여 mRNA로의 전사를 확인하였으며, western blot에 의해 형질전환 2계통 모두에서 약 27kDa의 band가 확인되어 도입유전자가 단백질로 발현됨을 확인할 수 있었다.
핵형분석 결과, 염색체 수는 H15와 B20 모두 2n = 24로 나타났으며, 이는 각각의 야생형 모본과 일치함을 확인하였다. 특히, H15와 야생형 모본, B20과 야생형 모본에서 이차협착부위로 인한 satellite의 위치와 수가 대조적인 차이를 보였다. H15와 야생형 모본은 2쌍(chromosome 11, 12)의 satellite chromosome이 관찰된 반면, B20과 야생형 모본은 1쌍의 satellite chromosome이 관찰되었다.
위 결과를 통해 CMV 저항성 형질전환체 고추의 분자생물학적 분석과 핵형분석으로 H15, B20에서 도입유전자가 안정되게 존재하며 발현되고 있음을 확인하였다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction = 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS = 7
• A. Plant materials = 7
• B. Molecular analysis = 7
• 1. DNA extraction (mini prep.) = 7
• 2. PCR = 8
• 3. DNA extraction (large prep.) = 8
• 4. DNA digestion and southern blot = 9
• 5. Total RNA extraction = 10
• 6. RT-PCR = 11
• 7. Total Protein preparation = 16
• 8. SDS-PAGE and western blot = 16
• C. Cytogenetic analysis = 18
• 1. Chromosome preparation = 18
• 2. Karyotype analysis = 18
• Ⅲ. Results = 20
• A. Analysis of transgene existence and expression = 20
• 1. PCR analysis = 20
• 2. Southern blot analysis = 21
• 3. RT-PCR analysis = 27
• 4. Western blot analysis = 27
• B. Cytogenetic analysis = 35
• Ⅳ. Discussion = 45
• REFERENCES = 48
• 국문초록 = 56